Tha e ainmeil gur e RNA an eadar-mheadhanair tar-sgrìobhaidh eadar DNA agus abairt pròtain anns a’ dogma sa mheadhan.An coimeas ri lorg DNA, faodaidh lorg RNA nochdadh nas cinntiche air abairt gine ann am fàs-bheairtean.Am measg nan deuchainnean anns a bheil RNA tha: qRT-PCR, RNA-Seq, agus lorg gine fusion, msaa.Sguab a-steach, sgudal a-mach, mura h-eil càileachd RNA math, feumaidh na toraidhean deuchainneach a bhith neo-thaitneach, gu sònraichte air am foillseachadh mar dàta mearachdach no droch ath-aithris.Mar sin, bu chòir barrachd aire a thoirt do ghiollachd RNA, agus tha ceangal smachd càileachd cuideachd nas cudromaiche gus dèanamh cinnteach gu bheil cruinneas agus neo-mhearachdachd dàta deuchainneach às deidh sin.

Airson smachd càileachd RNA, mar as trice tha na dòighean a leanas air an cleachdadh:

• Spectrophotometry
• electrophoresis gel agarose
• Bith-anailisiche Agilent
• PCR cainneachdail fluorescent fìor-ùine
• Modh dath fluorescent Qubit

01 Spectrophotometry

Tha bannan dùbailte co-chuingealaichte aig RNA agus tha stùc in-ghabhail aige aig tonn-tonn de 260nm.A rèir lagh Lambert-Beer, is urrainn dhuinn an dùmhlachd RNA obrachadh a-mach bhon stùc in-ghabhail aig 260nm.A bharrachd air an sin, is urrainn dhuinn cuideachd purrachd RNA obrachadh a-mach a rèir a ’cho-mheas de stùcan in-ghabhail 260nm, 280nm agus 230nm.Is e 280nm agus 230nm na binneanan in-ghabhail de phròtainean agus moileciuilean beaga, fa leth.Bu chòir an co-mheas de A260/A280 agus A260/A230 de ghlan RNA teisteanasach a bhith nas àirde na 2. Ma tha e nas lugha na 2, tha e a’ ciallachadh gu bheil truailleadh pròtain no moileciuil beag anns an sampall RNA agus feumar a ghlanadh a-rithist.Bheir stòran truailleadh buaidh air deuchainnean sìos an abhainn, leithid bacadh air èifeachdas leudachaidh ath-bheachdan PCR, a’ leantainn gu toraidhean cainneachdail mearachdach.Tha buaidh mhòr aig purrachd RNA air toraidhean às deidh sin, agus mar sin tha spectrophotometry mar as trice na cheangal smachd càileachd riatanach anns a’ chiad cheum ann an deuchainnean searbhag niuclasach.

Figear 1. Speactrom Ion-ghabhail RNA/DNA àbhaisteach

02 Electrophoresis gel agarose

A bharrachd air purrachd, tha ionracas RNA cuideachd mar aon de na comharran cudromach airson a bhith a’ breithneachadh càileachd RNA.Leanaidh truailleadh RNA gu àireamh mhòr de mhìrean goirid san sampall, agus mar sin thèid an àireamh de mhìrean RNA a lorgar gu h-èifeachdach agus a chòmhdach leis an t-sreath iomraidh a lughdachadh.Faodar iomlanachd RNA a sgrùdadh le electrophoresis de RNA iomlan air gel agarose 1%.Faodaidh an dòigh seo an gel a rèiteachadh thu fhèin, no an siostam E-Gel ™ ro-thogte a chleachdadh airson deuchainn ionracas.Tha còrr air 80% den RNA iomlan na RNA ribosomal, agus tha a’ mhòr-chuid dheth air a dhèanamh suas de 28S agus 18S rRNA (ann an siostaman mamalan).Seallaidh RNA de dheagh chàileachd dà bhàr soilleir follaiseach, a tha nan bàraichean soilleir 28S agus 18S, fa leth, aig 5 Kb agus 2 Kb, agus bidh an co-mheas buailteach a bhith faisg air 2: 1.Ma tha e ann an staid sgaoilte, tha e a’ ciallachadh gur dòcha gu bheil an sampall RNA air a dhol sìos, agus thathas a’ moladh an dòigh a chaidh a mhìneachadh nas fhaide air adhart a chleachdadh gus tuilleadh deuchainn a dhèanamh air càileachd RNA.

Figear 2. Coimeas eadar RNA truaillidh (sreath 2) agus RNA iomlan (sreath 3) air electrophoresis gel agarose

03 Bith-anailisiche Agilent

A bharrachd air an dòigh electrophoresis gel agarose a tha air a mhìneachadh gu h-àrd, a chuidicheas sinn gus ionracas RNA a chomharrachadh gu sìmplidh agus gu sgiobalta, is urrainn dhuinn cuideachd an Agilent bioanalyzer a chleachdadh gus ionracas RNA a dhearbhadh.Bidh e a’ cleachdadh measgachadh de microfluidics, electrophoresis capillary, agus fluorescence gus dùmhlachd agus ionracas RNA a mheasadh.Le bhith a’ cleachdadh an algairim togte gus mion-sgrùdadh a dhèanamh air ìomhaigh an t-sampall RNA, faodaidh an bioanalyzer Agilent obrachadh a-mach luach iomlanachd RNA iomraidh, Àireamh Ionracas RNA (ris an canar RIN an-seo mar RIN) [1].Mar as motha a tha luach RIN, is ann as àirde ionracas an RNA (tha 1 air a dhol sìos gu mòr, is e 10 an tè as coileanta).Tha cuid de dheuchainnean anns a bheil RNA a’ moladh a bhith a’ cleachdadh RIN mar pharamadair airson measadh càileachd.Le bhith a’ gabhail dheuchainnean seicheamhachaidh àrd-thruaighe (ris an canar NGS an-seo) mar eisimpleir, tha stiùireadh Oncomine ™ Human Immune Repertoire, a thathas a’ cleachdadh gus gabhadairean antigen cealla B agus T a lorg ann an sreath pannal Thermo Fisher's Oncomine, a’ moladh gum faodar sampallan le luachan RIN nas àirde na 4, leughaidhean agus clones nas èifeachdaiche a thomhas (Figear 3).Tha diofar raointean air am moladh airson diofar phannalan, agus gu tric faodaidh RIN nas àirde dàta nas èifeachdaiche a thoirt a-steach.

Figear 3, ann an deuchainnean Repertoire Immune Daonna Oncomine ™, faodaidh sampallan le RIN nas motha na 4 leughaidhean nas èifeachdaiche agus clones cealla T a lorg.【2】

Ach, tha cuid de chuingealachaidhean aig luach RIN cuideachd.Ged a tha co-dhàimh àrd aig RIN ri càileachd dàta deuchainneach NGS, chan eil e freagarrach airson sampallan FFPE.Thathas air dèiligeadh gu ceimigeach ri sampallan FFPE airson ùine mhòr, agus mar as trice tha luach RIN gu math ìosal aig an RNA a chaidh a thoirt a-mach.Ach, chan eil seo a’ ciallachadh gum feum dàta èifeachdach an deuchainn a bhith neo-thaitneach.Gus measadh ceart a dhèanamh air càileachd sampallan FFPE, feumaidh sinn tomhasan a bharrachd air RIN a chleachdadh.A bharrachd air RIN, faodaidh bioanalyzer Agilent cuideachd luach DV200 obrachadh a-mach mar pharameter measaidh de chàileachd RNA.Is e paramadair a th’ ann an DV200 a bhios a’ tomhas a’ chuibhreann de mhìrean nas motha na 200 bp ann an sampall RNA.Tha DV200 na chomharradh nas fheàrr air càileachd sampall FFPE na RIN.Airson an RNA a chaidh a thoirt a-mach le FFPE, tha co-dhàimh fìor àrd aige leis an àireamh de ghinean a dh'fhaodar a lorg gu h-èifeachdach agus iomadachd ghinean [3].Ged as urrainn do DV200 dèanamh suas airson na h-uireasbhaidhean ann an lorg càileachd FFPE, chan urrainn don bioanalyzer Agilent fhathast mion-sgrùdadh coileanta a dhèanamh air na duilgheadasan càileachd ann an sampallan RNA, a’ toirt a-steach a bheil luchd-bacadh anns na sampallan.Faodaidh luchd-bacadh iad fhèin buaidh a thoirt air èifeachdas leudachaidh deuchainnean sìos an abhainn agus an ìre de dhàta feumail a lughdachadh.Gus faighinn a-mach a bheil neach-dìon anns an sampall, is urrainn dhuinn gabhail ris an dòigh PCR cainneachdail fluorescent fìor-ùine a tha air a mhìneachadh an ath rud.

04 PCR cainneachdail fluorescent fìor-ùine

Chan e a-mhàin gu bheil an dòigh cainneachdail fluorescent PCR fìor-ùine comasach air na luchd-dìon san t-sampall a lorg, ach cuideachd càileachd RNA anns an sampall FFPE a nochdadh gu ceart.An coimeas ri sgrùdairean bith-eòlasach Agilent, tha fèill mhòr air ionnstramaidean cainneachdail fluorescence fìor-ùine ann am prìomh deuchainn-lannan bith-eòlasach air sgàth an cleachdadh nas fharsainge.Gus càileachd sampallan RNA a dhearbhadh, chan fheum sinn ach probes primer a cheannach no ullachadh airson ginean fiosrachaidh a-staigh, leithid GUSB (Cat no. Hs00939627).Le bhith a’ cleachdadh an t-seata seo de primers, probes agus inbhean (RNA iomlan de dùmhlachd aithnichte) gus deuchainnean cainneachdail iomlan a dhèanamh, faodar an dùmhlachd criomag RNA èifeachdach a thomhas mar ìre measaidh càileachd RNA (Meudachadh RNA Gnìomhach (FRQ) airson ùine ghoirid).Ann an deuchainn NGS, lorg sinn gu bheil co-dhàimh fìor àrd aig FRQ de shamhlaichean RNA leis an tomhas dàta èifeachdach.Airson a h-uile sampall nas motha na 0.2ng / uL FRQ, faodaidh co-dhiù 70% de na leughaidhean còmhdach èifeachdach a dhèanamh air an t-sreath iomraidh (Figear 4).

Figear 4, tha co-dhàimh fìor àrd (R2> 0.9) aig an luach FRQ a chaidh a lorg leis an dòigh cainneachdail fluorescence leis an dàta èifeachdach a fhuaireadh ann an deuchainn NGS.Is e an loidhne dhearg an luach FRQ co-ionann ri 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

A bharrachd air a bhith buntainneach ri sampallan FFPE, faodaidh an dòigh PCR cainneachdail fìor-ùine sùil a chumail gu h-èifeachdach air luchd-dìon ann an sampallan.Is urrainn dhuinn an sampall a thèid a lorg a chuir a-steach don t-siostam ath-bhualadh le Smachd Deimhinneach Taobh a-staigh (IPC) agus an Assay aige, agus an uairsin dèan tomhas fluorescence gus an luach Ct fhaighinn.Ma tha an luach Ct air dheireadh air luach Ct anns an ath-bhualadh gun sampall, tha e a’ nochdadh gu bheil an neach-dìon an làthair anns an sampall agus a’ cur bacadh air èifeachdas leudachaidh san ath-bhualadh.

05 Modh dath fluorescent Qubit

Is e Qubit Fluorometer an inneal beag as cumanta airson dùmhlachd searbhag niuclasach agus lorg purrachd, a tha furasta obrachadh agus a tha ann an cha mhòr a h-uile obair-lann bith-eòlas moileciuil.Bidh e gu ceart a’ tomhas dùmhlachd searbhag niuclasach le bhith a’ lorg agus a’ lorg dath flùraiseach a tha ceangailte ri searbhag niuclasach (reagent lorg Qubit).Tha cugallachd agus sònrachas àrd aig Qubit, agus is urrainn dha RNA a thomhas gu ceart sìos gu dùmhlachd pg / µL.A bharrachd air a’ chomas a th’ ann a bhith a’ tomhas gu ceart dùmhlachd searbhag niuclasach, faodaidh am modal ùr as ùire aig Thermo Fisher, Qubit 4.0, ionracas RNA a lorg cuideachd.Bidh siostam lorg RNA Qubit 4.0 (Measadh RNA IQ) a’ lorg iomlanachd RNA le bhith a’ lorg dà dhath flùraiseach sònraichte aig an aon àm.Faodaidh an dà dhath flùraiseach seo ceangal ri mìrean mòra agus pìosan beaga de RNA, fa leth.Tha an dà dhath fluorescent seo a’ nochdadh a’ chuibhreann de mhìrean mòra de RNA san sampall, agus às an seo faodar an luach IQ (Ionracas agus Càileachd) a tha a’ riochdachadh càileachd RNA a thomhas.Tha an luach IQ buntainneach an dà chuid do shamhlaichean FFPE agus neo-FFPE, agus tha buaidh mhòr aige air càileachd sreathachaidh às deidh sin.A’ gabhail deuchainnean NGS mar eisimpleir, anns na deuchainnean deuchainn RNA-Seq a chaidh a dhèanamh air an àrd-ùrlar Ion torrent™, bha co-dhiù 50% de leughaidhean èifeachdach aig a’ mhòr-chuid de shamhlaichean le luachan IQ nas àirde na 4 (Figear 5).An coimeas ris na dòighean lorgaidh gu h-àrd, chan e a-mhàin gu bheil Qubit IQ Assay nas goireasaiche a bhith ag obair agus a’ toirt nas lugha de ùine (taobh a-staigh còig mionaidean), ach tha ceangal mòr aige cuideachd eadar luach paramadair IQ tomhaiste agus càileachd dàta deuchainnean sìos an abhainn.

Figear 5, tha co-dhàimh mhòr eadar luach Qubit RNA IQ agus na leughaidhean mapa de RNA-Seq.【5】

Tron ro-ràdh gu h-àrd, tha mi a’ creidsinn gu bheil tuigse gu leòr aig a h-uile duine air diofar dhòighean smachd càileachd RNA.Ann an cleachdadh, faodaidh tu taghadhan dòigh fhreagarrach a rèir an seòrsa sampall agus na h-ionnstramaidean a th’ ann.Is ann dìreach le bhith a’ cumail smachd air càileachd RNA gu math as urrainn dhuinn fàilligeadh deuchainnean às deidh sin air adhbhrachadh le droch chàileachd sampall, mar sin a’ sàbhaladh ùine luachmhor, lùth agus cosgais.

Bathar iomraidh:

Kit Iomallach RNA Iomlan bheathaichean

Cell Iomlan RNA Kit Iomallach

iomraidhean

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.An RIN: àireamh iomlanachd RNA airson luachan iomlanachd a shònrachadh do thomhasan RNA.Biol Molecular BMC 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Leabhar-iùil neach-cleachdaidh stòr dìonachd daonna (àireamh taigh-seinnse MAN0017438 An t-Urr. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrics Càileachd Àrdaichte airson a bhith a’ Measadh RNA a thàinig bho shamhlaichean clò-sgrìobhaidh le paraffin stèidhichte air paraffin stèidhichte, saidheans puinnseanta, Leabhar 170, 29 Lùnastal, 27https://doi.org/10.1093/toxsci/