• facebook
  • ceangailte
  • youtube
duilleag_bratach

Lasachadh mòr Sìona Mothachadh Àrd Aon-cheum Probe Rt-Qpcr Kit V2

Tuairisgeul Kit:

◮ Simple agus èifeachdach: le teicneòlas Cell Direct RT, gheibhear sampallan RNA ann an dìreach 7 mionaidean.

Tha iarrtas sampall beag, cho ìosal ri 10 ceallan faodar a dhearbhadh.

◮ Cur-a-steach àrd: is urrainn dha RNA a lorg gu luath ann an ceallan air an àiteachadh ann an truinnsearan 384, 96, 24, 12, 6-tobar.

Faodaidh DNA Eraser genomes a chaidh a leigeil ma sgaoil a thoirt air falbh gu sgiobalta, a’ bhuaidh air toraidhean deuchainneach às deidh sin a lughdachadh gu mòr.

Tha siostam RT agus qPCR leasaichte a’ dèanamh an tar-sgrìobhadh cùil RT-PCR dà-cheum nas èifeachdaiche agus PCR nas mionaidiche, agus nas seasmhaiche ri luchd-bacadh freagairt RT-qPCR.

neart a sheachnadh


Mion-fhiosrachadh toraidh

Bathar Tags

Ceistean Cumanta

Tha sinn air a bhith eòlach neach-dèanamh.A’ buannachadh a’ mhòr-chuid ann an teisteanasan deatamach a’ mhargaidh aige airson lasachadh mòr ann an Sìona High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Is e càileachd beatha factaraidh, Is e fòcas air iarrtas teachdaiche an stòr airson mairsinn agus leasachadh companaidh, Bidh sinn a’ cumail ri onair agus deagh bheachd obrach, a ’coimhead air adhart ri do thighinn!
Tha sinn air a bhith eòlach neach-dèanamh.A 'buannachadh a' mhòr-chuid ann an teisteanasan deatamach a 'mhargaidh airsonSìona Taq DNA Polymerase, Qpcr, Tha a’ chompanaidh againn a’ gealltainn: prìsean reusanta, ùine toraidh goirid agus seirbheis iar-reic riarachail, tha sinn cuideachd a’ cur fàilte oirbh tadhal air an fhactaraidh againn aig àm sam bith a thogras tu.Miann a-nis gum bi gnìomhachas tlachdmhor is fad-ùine againn còmhla !!!

Tuairisgeulan

Bidh an uidheamachd seo a’ cleachdadh siostam bufair lysis gun samhail a dh’ fhaodas RNA a leigeil ma sgaoil gu sgiobalta bho shamhlaichean cealla cultarach airson ath-bheachdan RT-qPCR, agus mar sin a’ cur às don phròiseas glanaidh RNA a tha a’ caitheamh ùine agus a’ saothair.Gheibhear an teamplaid RNA ann an dìreach 7 mionaidean.Faodaidh na h-ath-bheachdan 5 × Direct RT Mix agus 2 × Direct qPCR Mix-SYBR a thug an uidheamachd seachad toraidhean PCR cainneachdail fìor-ùine fhaighinn gu luath agus gu h-èifeachdach.

Tha fulangas dìon làidir aig 5 × Direct RT Mix agus 2 × Direct qPCR Mix-SYBR, agus faodar lysate nan sampallan a chleachdadh mar theamplaid airson RT-qPCR gu dìreach.Anns a’ ghoireas seo tha an transcriptase cùil Foregene àrd-dàimh sònraichte RNA, agus DNA polymerase Hot D-Taq, dNTPs, MgCl2, bufair freagairt, optimizer PCR agus stàball.

Sònrachaidhean

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Co-phàirtean kit

Pàirt I

Bufair CL

Foregene Protease Plus II

Bufair ST

Pàirt II

inneal-sgrios DNA

5 × measgachadh RT dìreach

2 × Dìreach qPCR Mix-SYBR

Dath iomraidh 50 × ROX

RNase-Free ddH2O

Stiùiridhean

Feartan & buannachdan

■ Simple agus èifeachdach: le teicneòlas Cell Direct RT, gheibhear sampallan RNA ann an dìreach 7 mionaidean.

■ Tha iarrtas sampall beag, cho ìosal ri 10 ceallan faodar a dhearbhadh.

■ Treòrachadh àrd: lorgaidh e RNA gu luath ann an ceallan a tha air an àiteachadh ann an truinnsearan 384, 96, 24, 12, 6-tobar.

■ Faodaidh DNA Eraser genomes a chaidh a leigeil ma sgaoil a thoirt air falbh gu sgiobalta, a’ lughdachadh gu mòr a ’bhuaidh air toraidhean deuchainneach às deidh sin.

■ Tha siostam RT agus qPCR leasaichte a’ dèanamh an tar-sgrìobhadh cùil RT-PCR dà-cheum nas èifeachdaiche agus PCR nas mionaidiche, agus nas seasmhaiche ri luchd-bacadh freagairt RT-qPCR.

Iarrtas kit

Farsaingeachd an tagraidh: ceallan cultarach.

- RNA air a leigeil ma sgaoil le sampall lysis: buntainneach a-mhàin ri teamplaid RT-qPCR den uidheamachd seo.

- Faodar an cromag a chleachdadh airson na h-adhbharan a leanas: mion-sgrùdadh faireachdainn gine, dearbhadh buaidh sàmhach gine le meadhan siRNA, sgrìonadh dhrogaichean, msaa.

Diagram

Diagram qPCR Cell Direct RT

Stòradh agus beatha sgeilp

Bu chòir pàirt I den phasgan seo a stòradh aig 4 ℃;Bu chòir Pàirt II a bhith air a stòradh aig -20 ℃.

Bu chòir Foregene Protease Plus II a bhith air a stòradh aig 4 ℃, na reothadh aig -20 ℃.

Reagent 2 × Direct qPCR Mix-SYBR bu chòir a stòradh aig -20 ℃ anns an dorchadas;ma thèid a chleachdadh gu tric, faodar cuideachd a stòradh aig 4 ℃ airson stòradh geàrr-ùine (cleachd taobh a-staigh 10 latha). Tha sinn air a bhith eòlach mar neach-dèanamh.A’ buannachadh a’ mhòr-chuid ann an teisteanasan deatamach a’ mhargaidh aige airson lasachadh mòr Sìona Sensitivity High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Is e càileachd beatha an fhactaraidh, fòcas air iarrtas teachdaiche na thùs airson mairsinn agus leasachadh companaidh, Bidh sinn a’ cumail ri onair agus deagh bheachd obrach, a’ coimhead air adhart ri do thighinn!
Lasachadh mòrSìona Taq DNA Polymerase, Qpcr, Tha a 'chompanaidh againn a' gealltainn: prìsean reusanta, ùine toraidh goirid agus seirbheis iar-reic riarachail, tha sinn cuideachd a 'cur fàilte oirbh tadhal air an fhactaraidh againn aig àm sam bith a tha thu ag iarraidh.Miann a-nis gum bi gnìomhachas tlachdmhor is fad-ùine againn còmhla !!!


  • Roimhe:
  • Air adhart:

  • QuickEàisTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

    Cat.No.DRT-01021/01022

    Airson cealla dìreach RT-qPCR a’ cleachdadh ≤ 1000,000 ceallan

    Ro-ràdh toraidh

    Bidh an toradh seo a’ cleachdadh siostam bufair lysis sònraichte gus RNA a leigeil ma sgaoil gu sgiobalta bho shamhlaichean cealla cultarach airson ath-bheachdan RT-qPCR, a’ cur às don phròiseas glanaidh RNA a tha a’ caitheamh ùine agus ag obair, agus dìreach 7 mionaidean gus an teamplaid RNA a tha a dhìth fhaighinn, leis an 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman air a thoirt seachad leis a’ phiseag toraidhean fìor-ùine PCR fhaighinn gu luath agus gu h-èifeachdach.

    Tha fulangas dìon làidir aig 5 × Direct RT Mix agus 2 × Direct qPCR Mix-Taqman agus faodaidh iad tionndadh èifeachdach agus leudachadh sònraichte a dhèanamh a’ cleachdadh lysate an t-sampall a thèid a thomhas mar theamplaid.Anns an ath-ghnìomhaiche tha Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, Bufair Reaction, PCR Optimizer agus Stabilizer, a dh'fhaodar a chleachdadh le bufair lysis gus sampallan a lorg gu luath agus gu furasta, agus aig a bheil feartan cugallachd àrd, sònrachas agus seasmhachd.

    Feartan toraidh

    Teicneòlas Cell Direct RT sìmplidh, èifeachdach a bheir cho beag ri 7 mionaidean airson sampallan RNA fhaighinn.

    Tha riatanasan sampall beag, agus faodar co-dhiù 10 ceallan cultarach a chleachdadh airson deuchainneachd.

    Treòrachadh àrd airson togail RNA luath de cheallan cultarach leithid 384, 96, 24, 12, agus truinnsearan 6-tobar.

    Tha DNA Eraser comasach air genomes a chaidh a leigeil ma sgaoil a thoirt air falbh gu sgiobalta, a’ lughdachadh gu mòr a ’bhuaidh air toraidhean deuchainneach às deidh sin.

    Tha siostaman RT agus qPCR làn-leasaichte a’ comasachadh RT-PCR dà-cheum le tar-sgrìobhadh cùil nas èifeachdaiche, sònrachas, agus fulangas dìon ath-bhualadh RT-qPCR nas làidire.

    Iarrtas kit

    Farsaingeachd an tagraidh: ceallan cultarach.

    Sampall lysis air a mhìneachadh RNA: air a chleachdadh a-mhàin mar theamplaid RT-qPCR dà-cheum.

    Faodar innealan a chleachdadh airson na h-adhbharan a leanas: mion-sgrùdadh abairt riaghlaidh gine, deuchainn allele, sgrìonadh dhrogaichean, msaa.

    Cuingeachaidhean Kit

    Mìrean meudaichte ≤ 300 bp.

    Bithear a’ cleachdadh innealan gus ceallan a thogail às ùr.

    Smachd càileachd toraidh

    A rèir Siostam Riaghladh Càileachd Iomlan FOREGENE, tha gach baidse de innealan sreath Cell Direct RT-qPCR air a dhearbhadh gu cruaidh grunn thursan gus dèanamh cinnteach à earbsachd agus seasmhachd càileachd gach baidse de chit.

    Susbaint Kit

    QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit-Taqman
    Kit co-phàirtean20 μl qPCR Reaction System DRT-01021 DRT-01022 Thoir an aire
    200 T 1000 T
     

    Pàirt I

    Bufair CL 4 ml 20 ml  

     

    Cealla Lysis

    Foregene Protease Plus II 80 μl 400 μl
    Bufair ST 400 μl 1 ml × 2
     

     

    Pàirt II

    inneal-sgrios DNA 80 μl 400 μl
    5 × measgachadh RT dìreach * 160 μl 800 μl RT
    2 × Dìreach qPCR Mix-Taqman * 1 ml × 2 1,7 ml × 6 qPCR
    Dath fiosrachaidh 20 × ROX 40 μl 200 μl
    RNase-Free ddH2O 1,7 ml 10 ml

    Leabhar-làimhe stiùiridh

    1 phìos

    1 phìos

    *:Faodar Cell Lysis, 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman a cheannach air leth, tha mion-fhiosrachadh ann am Pàipear-taice 1 (Duilleag 13).

    Suidheachadh stòraidh

    1. Cumhachan Luingeis

    A’ phròiseas iomlan de ghiùlan bogsa pacaid deigh aig teòthachd ìosal, gus dèanamh cinnteach gu bheil am pasgan anns an stàit <4 ° C.

    2. Suidheachadh stòraidh

    Cùm pàirt I aig 4 ° C agus Pàirt II aig -20 ° C.

    Bu chòir an Foregene Protease Plus II a stòradh aig 4 ° C, gun a bhith reòta aig -20 ° C.

    Reagent 2 × Direct qPCR Mix-Taqman air a stòradh aig -20 ° C, no aig 4 ° C airson cleachdadh geàrr-ùine ma thèid a chleachdadh gu tric (taobh a-staigh 10 latha).

    Fiosrachadh mu cho-phàirtean Kit

    Buffer CL: A 'toirt seachad an àrainneachd a tha riatanach airson ath-bheachdan lysis cealla.

    Buffer ST: A 'cur crìoch air an stuth gnìomhach anns an lysate gus buaidhean air RT a sheachnadh.

    DNA Eraser: toirt air falbh DNA, buaidh toirt air falbh an genoma air deuchainnean às deidh sin.

    5 × Direct RT Mix: A’ toirt a-steach dàimh RNA àrd Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPn, stabilizers, enhancers, optimizers, agus primers tar-sgrìobhaidh cùil airson an co-thaobhadh as fheàrr (Random Primer, Oligo (dT)18Primer).

    Foregene Protease Plus II: Ann an co-theacsa bufair lysis, tha ceallan air an sgeadachadh gus searbhagan niuclasach a leigeil ma sgaoil.

    2 × Direct qPCR Mix-Taqman: Anns an ath-ghnìomhach seo tha Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, bufair freagairt, optimizer PCR, agus stàball.

    Dath iomraidh 20 × ROX: Mar as trice air a chleachdadh air ionnstramaidean leudachaidh PCR Real Time de ABI, Stratagene agus companaidhean eile, tha e air a chleachdadh gus an eadar-dhealachadh eadar pìoban PCR agus tiùban air adhbhrachadh le mearachdan dosing PCR atharrachadh.Tha an dùmhlachd dath iomraidh 20 × ROX a tha riatanach airson diofar ionnstramaidean eadar-dhealaichte, agus faodaidh an neach-cleachdaidh a chuir ris a rèir an dùmhlachd a thathar a’ moladh den ionnstramaid.

    Gun RNase ddH2O: uisge fìor-ghlan sterilichte gun RNase airson ath-bheachdan RT-qPCR dà-cheum.

    Earalasan:(Dèan cinnteach gun leugh thu na ceumannan gu faiceallach mus cleachd thu am pasgan)

    Thoir aire do dhòigh obrachaidh an deuchainn gus tar-thruailleadh eadar sampallan a sheachnadh.

    Thoir aire do ghlainead na h-àrainneachd deuchainneach agus innealan gus truailleadh RNase agus truailleadh RNA a sheachnadh.

    Gabh sampallan cealla ùr no air an deagh ghleidheadh ​​​​agus na cleachd sampallan cealla reòta a-rithist.

    Bu chòir 5 × Direct qPCR Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman a bhith a’ seachnadh reothadh-loisgte, air neo bheir e buaidh air tar-sgrìobhadh air ais agus èifeachdas PCR.

    Ullaichcuibhreannanroimheobrachadh

    Dèan cinnteach gun leugh thu an stiùireadh gu faiceallach mus cleachd thu am pasgan seo.Tha an Kit RT-qPCR Cell Direct sìmplidh, goireasach agus luath airson obrachadh, agus tha an stiùireadh a’ toirt seachad fiosrachadh iomlan mun chidsin gu lèir agus mar a chleachdas tu e gu ceart.Feuch an ullaich thu na stuthan deuchainneach agus an uidheamachd riatanach mus cleachd thu iad.

    Stuthan agus uidheamachd deuchainneach

    ◆ Cultar ceallan.

    ◆ 1.5 ml no 2 ml, tiùb centrifuge gun RNase-/DNase, tip gun RNase-/DNase-Free, tiùb qPCR sterile 0.2 ml.

    ◆ inneal qPCR, pìob, centrifuge clàr-bùird (13,400×g) (a rèir feumalachdan deuchainneach), msaa.

    Sàbhailteachd

    ◆ Tha an toradh seo airson adhbharan rannsachaidh saidheansail a-mhàin, feuch nach cleachd thu e airson adhbharan cungaidh-leigheis, clionaigeach, bìdh agus cosmaigeach.

    ◆ Nuair a bhios tu a’ cleachdadh cheimigean, cuir ort aodach obair-lann iomchaidh, miotagan, glainneachan dìon, msaa.

    Obrachaidhiùil

    Faodar siostaman Cell Lysis, siostaman RT, agus pacaidean leasachaidh fuasgladh freagairt qPCR a cheannach air leth, airson mion-fhiosrachadh ann am Pàipear-taice 1 (Duilleag 13).

    Stiùireadh gnìomh

    A: Eisimpleir de sgaoileadh RNA

    1.Chaidh na ceallan a làimhseachadh ro-làimh: Nigh am plàta cultar cealla le PBS fuar, an uairsin cuir na ceallan (10-106), 106 na an àireamh de cheallan, thathas a’ moladh Foregene the Cell an Kit Iomallach RNA an Iomlan (DE-03111) no Kit Iomallach Iomlan RNA Ainmhidhean (DE-03011) airson às-tharraing agus glanadh RNA.

    1.1.Ceallan ceangailte (plàta 24-tobar mar eisimpleir)

    1.1.1.Obraich a-mach an àireamh de cheallan anns gach tobar, co-dhùin gur e 1 × 10 an àireamh de cheallan5, agus cleachd pìobaire gus am meadhan cultair a thoirt air falbh bhon mhias cultair.

    1.1.2.Cuir 200 μl de 1 × PBS ro-fhuarach ris gach tobar.Na bi a’ pìobadh a-rithist is a-rithist agus thoir air falbh PBS bho na tobraichean.Teilt a’ phlàta agus thoir air falbh nas urrainn dhut de PBS.Lean air adhart gu ceum 2.

    1.1.3.Chaidh diofar mhias cultar cealla no clàr àireamh iomraidh 1-1 ann am mias cultar cealla a chuir ris precooled 1 × PBS airson nighe cheallan.

    Clàr 1-1: PBS dosage airson diofar àireamhan de cheallan

    Seòrsa clàr cultar

    Àireamh de cheallan / tobar

    1 × PBS / gu math

    6 - gu math

    1 × 106

    1000 μl

    12 - gu math

    2 × 105

    400 μl

    24 - gu math

    105

    200 μl

    96 - gu math

    104

    50 μl

    384 - gu math

    5×103

    25 μl

    Thoir an aire:Gus dèanamh cinnteach gu bheil ceallan teann teannàireamh mhòr de chall cealla air a sheachnadh nuair a thathar a’ nighe.

    1.2.Ceallan crochaidh no ceallan gleidhidh air an àiteachadh ann am plèanaichean neo-porous

    1.2.1.Bidh ceallan ceangailte air an àiteachadh ann am pleitean neo-ioma tobar (bidh ceallan crochaidh a’ tòiseachadh bhon ath cheum 1.2.2), cruinnich agus dealaich na ceallan a rèir an dòigh cruinneachaidh cealla àbhaisteach, agus cuir iad ann am plàta cultair no tiùb centrifuge;ma thèid trypsinization a chleachdadh, feumar centrifugation gus na ceallan a chruinneachadh agus gus trypsin a tha air fhàgail a thoirt air falbh, cuir ceallan ath-chuir PBS a-steach do cheallan fa leth gus na ceallan a sgaoileadh.

    1.2.2.Às deidh an àireamh de cheallan a chaidh a chunntadh, cuir às do cheallan 1 × 105 aon gu pìoban centrifuge, cruinnich ceallan le centrifugation aig 1000 × g airson 10 min.

    1.2.3.Cuir 200 μl PBS ris an tiùb centrifuge, na bi a’ pìobadh a-rithist agus a-rithist, agus gu dìreach ag amas air an PBS.lean air adhart gu ceum 2. (Ma tha e duilich a dhùsgadh agus na ceallan air an ath-chuairteachadh a-rithist, faodar an coileanadh 1000 × g centrifuged 10 min às deidh dhaibh an supernatant a thoirt air falbh, lean am peileag cealla gu ceum 2)

    2.Cell lysis: Thoir air falbh Buffer CL, an teòthachd aige air a chothromachadh gu teòthachd an t-seòmair, DNA Eraser agus Foregene Protease Plus II, a rèir a 'chlàr a leanas 1-2 siostam lysis ullaichte: (Tha fuasgladh Lysis deiseil airson a chleachdadh).

    Clàr 1-2: cleavage ullachadh siostam (Nòta: ann an ullachadh air deigh)

    Comh-phàirt

    (Cell Lysis Master Mix)

    Plàta 6-tobar

    Plàta 12-tobar

    Plàta 24-tobar

    truinnsear 96-tobar

    384 - truinnsear tobar

    1000 μl / gu math

    400 μl / gu math

    200 μl / gu math

    50 μl / gu math

    25 μl/gu math

    Bufair CL

    960 μl

    384 μl

    192 ¼l

    48 µl

    24 µl

    inneal-sgrios DNA

    20 μl

    8 µl

    4 µl

    1 μl

    0.5 μl

    Foregene Protease Plus II

    20 μl

    8 µl

    4 µl

    1 µl

    0.5 μl

    3.( 24 - truinnsear tobar mar eisimpleir) Pìob 200 μl de mhaighstir lysis cealla a’ measgachadh a-steach do gach tobar, A-rithist sèideadh 5-10 tursan, Incubate aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) airson 5 min.

    Thoir an aire:Gus cruthachadh builgeanan a sheachnadh, feuch nuair a chaidh sgèile pìobaireachd pìobaireachd atharrachadh gu 200μl no nas lugha.Faodaidh na ceallan nochdadh sgòthach às deidh lysis, rud a tha àbhaisteach.

    4.(24 – truinnsear tobar mar eisimpleir) air a chur ris anns an leaghan 20 μl Buffer ST (diofar shiostaman lysis Buffer ST air a chur ris ann an suim a chithear ann an Clàr 1-3), ath-phìobaireachd 5-10 tursan, aig teòthachd an t-seòmair (20-25 ℃) air an goir airson 2 min.

    Thoir an aire:Chuir tip a’ phìobaire sìos fon uachdar, a’ dèanamh cinnteach gun deach an lysate a chur risgus cruthachadh builgeanan a sheachnadh, feuch nuair a chaidh sgèile pìobaireachd pìobaireachd atharrachadh gu 200μl no nas lugha.

    Clàr 1-3:Cuir a-steach Buffer ST

    Bufair ST

    6 - clàr gu math

    12 - clàr gu math

    24 - clàr tobar

    96 - clàr gu math

    384 - clàr tobair

    100 μl / gu math

    40 μl / gu math

    20 μl / gu math

    5 μl/gu math

    2.5 μl / gu math

    5.Tha an lysate air a chleachdadh airson deuchainnean RT-qPCR an dèidh sin.Mura h-urrainnear na deuchainnean às deidh sin a dhèanamh ann an ùine, feuch an cùm thu e air deigh gun a bhith nas fhaide na 2 uair, agus stòr aig -20 ℃ no -80 ℃ (gun a bhith nas fhaide na trì mìosan).

    B: RT ullachadh siostam

    1.Take a-mach 5 × Direct RT Mix agus cuir e air amar deigh, leig leis leaghadh gu nàdarrach, agus measgachadh gu socair e airson a chleachdadh nas fhaide air adhart;thoir a-mach ddH2O gun RNase agus leaghadh e agus cuir air amar deigh airson a chleachdadh nas fhaide air adhart.Ullaich an siostam reaction air deigh a rèir Clàr 2-1 gu h-ìosal.

    Clàr 2-1: Ag ullachadh siostam freagairt RT

    Siostam RT cuir susbaint ris

    Leis an t-suim

    Co-chruinneachadh deireannach

    5 × Direct RT Mix

    4 µl

    8 gul

    1 ×

    Cell Lysates (teamplaid RNA)

    4 μl

    8 gul

    Cuir ris an raon atharrachadh

    (10-40%)

    Gun RNase ddH2O

    12 μl

    24 μl

    -

    Meud iomlan

    20 μl

    40 μl

    -

    2.After crìochnachadh cruthachadh siostam, socair measgachadh agus centrifuged goirid anns a 'chlàr a leanas 2 -2 suidheachaidhean freagairt RT reaction.

    Clàr 2-2: Suidheachadh suidheachadh RT Reaction

    Ceum

    Teòthachd

    uair

    susbaint

    1

    42°C

    15-30 min

    synthesis cDNA

    2

    95 °C

    5 min

    Tar-sgrìobhadh cùl neo-ghnìomhach

    3

    4°C

    Chan eil

    3.An dèidh crìoch a chur air an ath-bhualadh, chaidh an toradh ath-bhualadh a chuir gu dìreach air deigh airson qPCR, feuch an cuir thu an gleidheadh ​​​​fad-ùine -20 ℃ no -80 ℃.

    Nota: Mar thoradh air a bhith a’ cleachdadh teamplaid neo-ghlan, faodaidh sileadh geal nochdadh anns an toradh tar-sgrìobhaidh cùil.Is e iongantas àbhaisteach a tha seo.Centrifuge an supernatant sa bhad airson deuchainnean às deidh sin.

    Tha am fuasgladh ath-bhualadh RT mar thoradh air sin air a chur ris an ath cheum siostaman freagairt PCR Real Time, thathas a’ moladh suimean eadar 10-30% den t-siostam ath-bhualadh a chuir ris.

    C: ullachadh siostam freagairt qPCR

    1.Appropriate suim B ullachadh ann an ceum cDNA teamplaid a rèir a 'chlàr a leanas 3-1 ullachadh siostam reaction.

    Nota: Tha an àireamh de theamplaid cDNA a’ dèanamh suas 10-30% den t-siostam qPCR.Mar eisimpleir, ann an siostam 20μl qPCR, cuir 2-6 μl de lysis bufair, ach chan eil barrachd air 6 μl.

    2.An optimachadh deagh shuidheachaidhean qPCR (Teòthachd Annealing, msaa) airson freagairt qPCR (Na cumhaichean freagairt a tha air an toirt seachad ann an Clàr 3-2).

    Nota: Feuch ri suidheachaidhean as fheàrr a chleachdadh airson ath-bheachdan qPCR gus toraidhean nas fheàrr fhaighinn.

    Clàr 3-1: Ag ullachadh siostam freagairt PCR

    Siostam RT cuir susbaint ris

    Leis an t-suim

    Co-chruinneachadh deireannach

    2 × Dìreach qPCR Mix-Taqman 10 μl 1 ×
    Air adhart Primer (10μM) 0.4 μl 50-900nM 1*
    Reverse Primer (10μM) 0.4 μl 50-900nM 1*
    Sgrùdadh (10μM) 0.2 μl 200nM
    teamplaid cDNA (air fhaighinn ann an ceum B) 4 μl 10-30%
    RNase-Free ddH2O -
    Dath iomraidh 20 × ROX 3* - -
    Meud iomlan 20 μl

    1 *: Faodar dùmhlachd primer atharrachadh anns an raon de 50-900 nM nuair a tha coileanadh freagairt primer truagh.

    Nota: Faodar an siostam qPCR atharrachadh a rèir feumalachdan deuchainneach agus modal cearcall fluorescence.Airson qPCR ann an 50μl siostam, atharraich an dosachadh reagent gu co-rèireach a rèir an 20μl siostam.

    Inneal PCR fìor-ùine Cruinneachadh deireannach ROX Reference Dye
    ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT/Ceum a h-Aon, msaa. 1 × (me. siostam 20 μl, cuir 1 μl 20 × ROX Reference Dye)
    ABI 7500/7500 Fast agus StratageneMx3000P/Mx3005P/Mx4000, etc. 0.5 × (me. siostam 20 μl, cuir 0.5 μl 20 × ROX ReferenceDye)

    2 *: Tagh an dùmhlachd deireannach iomchaidh de ROX Reference Dye a rèir an cearcall teirmeach cainneachdail fluorescence.Tha na cuibhreannan dath ROX iomraidh as iomchaidh airson cearcallan cainneachdail fluorescence air an sealltainn sa chlàr gu h-ìosal:

    Clàr 3-2: Tha suidheachaidhean freagairt qPCR air an toirt seachad

    Dà-cheum

    Teòthachd

    Uair

    Rothaichean

    Susbaint

    1 95 ℃ 3 min 1

    Predenaturation

    2 95 ℃ 5-10 diog 40

    Seòrsachadh teamplaid

    3 60-65 ℃ 20-30 diog

    Annealing/Leudachadh

    Nota: Gus a’ bhuaidh qPCR as fheàrr fhaighinn, faodar caisead PCR a chleachdadh gus na suidheachaidhean freagairt as fheàrr a dhèanamh airson diofar theamplaidean agus diofar primers.Bidh suidheachaidhean freagairt PCR ag atharrachadh a rèir an anailisiche fluorescence, teamplaid, primer, msaa.

    Prionnsabalan dealbhaidh fìor-ùine PCR primer

    Air adhart Primer agus Reverse Primer

    Airson Real Time PCR, tha dealbhadh primer glè chudromach.Tha primers co-cheangailte ri sònrachas agus èifeachdas leudachadh PCR, agus faodar an dealbhadh le iomradh air na prionnsapalan a leanas:

    ◆ Primer fad: 18-30bp.

    ◆ GC susbaint: 40-60%.

    ◆ Luach Tm: Faodaidh bathar-bog dealbhaidh primer, leithid Primer 5, luach Tm a’ phrìomhaire a thoirt seachad.Bu chòir luachan Tm nan primers suas an abhainn agus sìos an abhainn a bhith cho faisg ‘s a ghabhas.Faodar am foirmle àireamhachaidh Tm a chleachdadh cuideachd: Tm = 4 ° C (G + C) + 2 ° C (A + T).Nuair a bhios tu a’ coileanadh PCR, tha teòthachd nas ìsle na luach Tm primer de 5 ° C mar as trice air a thaghadh mar an teòthachd annealing (faodaidh an àrdachadh co-fhreagarrach ann an teòthachd analachaidh sònrachas an ath-bhualadh PCR àrdachadh).

    ◆ Primers agus PCR bathar:

    ◆ Is fheàrr fad toraidh leudachaidh PCR primer dealbhaidh 100-150bp.

    ◆ Bu chòir primers dealbhaidh ann an raon structarail àrd-sgoile an teamplaid a sheachnadh cho mòr 'sa ghabhas.

    ◆ Seachain a bhith a 'cruthachadh 2 ionad co-phàirteach no barrachd eadar na 3' cinn de phrìomhairean suas an abhainn agus sìos an abhainn.

    Chan urrainn bunait crìochnachaidh ◆ Primer 3 ′ a bhith an làthair le 3 G no C leantainneach a bharrachd.

    ◆ Chan urrainn structaran co-phàirteach a bhith aig na primers fhèin, air neo thèid structar hairpin a chruthachadh, a bheir buaidh air leudachadh PCR.

    ◆ Bu chòir ATCG a bhith air a chuairteachadh cho cothromach 's as urrainn anns an t-sreath primer, agus bu chòir bunait crìochnachaidh 3 ′ a sheachnadh mar T.

    Pàipear-taice1:Cell DìreachRT-qPCR Com-pàirt Kitt pacaid a bharrachd

    Fuasgladh Lysis 1.Cell


    Fuasgladh Cell Lysis

    Co-phàirtean kit

    (siostam lysis 24-tobar / tobar)

    DRT-01011-A1

    DRT-01011-A2

    100 T

    500 T

    Pàirtmi

    Bufair CL

    20 ml

    100 ml

    Foregene Protease Plus II

    400 μl

    1 ml × 2

    Bufair ST

    1 ml × 2

    10 ml

    PàirtII

    inneal-sgrios DNA

    400 μl

    1 ml × 2

     

    2.RT Measgachadh


    Measgachadh RT

    Co-phàirtean kit

    (siostam freagairt 20 μl)

    DRT-01011-B1

    200 T

    5 × measgachadh RT dìreach

    800 μl

    Gun RNase ddH2O

    1,7 ml × 2

    Measgachadh 3.qPCR


    measgachadh qPCR

    Co-phàirtean kit

    (siostam freagairt 20 μl)

    DRT-01021-C1

    DRT-01021-C2

    200 T

    1000 T

    2 × Dìreach qPCR Mix-Taqman

    1 ml × 2

    1,7 ml × 6

    Dath iomraidh 20 × ROX

    40 μl

    200 μl

    Gun RNase ddH2O

    1,7 ml

    10 ml

    Saoghal an t-saoghail

    Tha Foregene Co., Ltd

    Fòn: 028-83360257, 028-83361257

    E-mail :info@foregene.com

    Http://www.foregene.com

    Sgrìobh do theachdaireachd an seo agus cuir thugainn e