1. Tuigse air tùs
Aig an ìre seo, feumaidh sinn cuid de bhun-bheachdan agus briathrachas a thuigsinn, gus nach dèan sinn mearachdan air beulaibh ar seann daoine, leithid:
C: Dè an diofar eadar RT-PCR, qPCR, PCR fìor-ùine, agus RT-PCR fìor-ùine?
Freagairt: Tha RT-PCR na PCR tar-sgrìobhaidh cùil(tar-sgrìobhadh cùil PCR, RT-PCR), a tha na atharrachadh farsaing de fhreagairt slabhraidh polymerase (PCR).Ann an RT-PCR, tha dualan RNA air a thionndadh air ais gu DNA co-phàirteach, a tha an uairsin air a chleachdadh mar theamplaid airson leudachadh DNA le PCR.
Fìor-ùine-PCR agus qPCR(Cainneachdail Rea-ltime-PCR) an aon rud, tha an dà chuid PCR cainneachdail fìor-ùine, a tha a’ ciallachadh gu bheil clàran dàta fìor-ùine aig gach cearcall de PCR, agus mar sin faodar an àireamh de theamplaidean tòiseachaidh atharrachadh mion-sgrùdadh mionaideach.
Ged a tha coltas gu bheil an dà chuid PCR Real-time (PCR cainneachdail fìor-ùine) agus ath-sgrìobhadh Reverse PCR (PCR ath-sgrìobhadh cùil) air an giorrachadh mar RT-PCR, is e an co-chruinneachadh eadar-nàiseanta: Tha RT-PCR gu sònraichte a’ toirt iomradh air tar-sgrìobhadh cùil.Tha PCR, PCR fìor-ùine mar as trice air a ghiorrachadh mar qPCR (PCR cainneachdail fìor-ùine).
Agus RT-PCR fìor-ùine (RT-qPCR), Is e seo an tar-sgrìobhadh cùil PCR còmhla ris an teicneòlas cainneachdail fluorescent: an toiseach faigh cDNA (RT) bho ath-sgrìobhadh cùil RNA, agus an uairsin cleachd PCR fìor-ùine airson mion-sgrùdadh cainneachdail (qPCR).Bidh a’ mhòr-chuid de deuchainn-lannan a’ dèanamh RT-qPCR, is e sin, rannsachadh air abairt RNA sìos-riaghladh, agus mar sin tha an qPCR air a bheil a h-uile duine a’ bruidhinn san obair-lann a’ toirt iomradh air RT-qPCR, ach na dìochuimhnich gu bheil mòran dheuchainnean DNA ann fhathast ann an tagraidhean clionaigeach.Mion-sgrùdadh cainneachdail, leithid lorg bhìoras hepatitis B HBV.
Ceist: Às deidh dhut tòrr PCR cainneachdail fluorescent a leughadh, carson a bu chòir smachd a chumail air a’ chriomag meudaichte taobh a-staigh raon 80-300bp?
Freagairt: Tha fad gach sreath gine eadar-dhealaichte, tha cuid grunn kb, tha cuid nan ceudan de bp, ach chan fheum sinn ach a bhith ag iarraidh gum bi fad an toraidh 80-300bp nuair a bhios sinn a’ dealbhadh primers, ro ghoirid no ro fhada nach eil freagarrach airson lorgadh cainneachdail PCR .Tha an criomag toraidh ro ghoirid airson a bhith eadar-dhealaichte bhon primer-dimer.Tha fad an primer-dimer timcheall air 30-40bp, agus tha e duilich faighinn a-mach an e primer-dimer a th ’ann no toradh ma tha e nas lugha na 80bp.Ma tha an criomag toraidh ro fhada, nas àirde na 300bp, bheir e gu furasta gu èifeachdas leudachaidh ìosal agus chan urrainn dha meud a’ ghine a lorg gu h-èifeachdach.
Mar eisimpleir, nuair a tha thu a’ cunntadh cia mheud duine a tha ann an seòmar-teagaisg, cha leig thu leas ach cunntadh cia mheud beul a th’ ann.Tha an aon rud fìor nuair a lorgas tu ginean, chan fheum thu ach sreath sònraichte de ghine a lorg gus riochdachadh Nì an t-sreath gu lèir.Ma tha thu airson daoine a chunntadh, feumaidh tu an dà chuid beul is sròinean, cluasan agus glainneachan a chunntadh, agus tha e furasta mearachdan a dhèanamh.
Gus leudachadh, ann an rannsachadh bith-eòlasach, tha mòran chùisean rannsachaidh ann bho àite gu sgìre, leis gu bheil an t-sreath gine de ghnè sam bith glè fhada, tha e neo-riatanach agus do-dhèanta a h-uile criomag a thomhas, leithid sreath 16S bacterial, a tha a’ dèanamh an t-sreath glèidhidh de mheasaidhean bacteria gus an àireamh de shluagh sònraichte de bacteria a thoirt a-steach.
C: Dè an fhaid as fheàrr airson dealbhadh primer qPCR?
Freagairt: San fharsaingeachd, tha fad an primer mu 20-24bp, a tha nas fheàrr.Gu dearbh, feumaidh sinn aire a thoirt do luach TM an primer nuair a bhios sinn a ’dealbhadh an primer, oir tha seo co-cheangailte ris an teòthachd annealing as fheàrr.Às deidh mòran dheuchainnean, chaidh a dhearbhadh gu bheil 60 ° C na luach TM nas fheàrr.Ma tha an teòthachd annealing ro ìosal, bidh e furasta leantainn gu leudachadh neo-shònraichte.Ma tha an teòthachd annealing ro àrd, bidh an èifeachdas leudachaidh an ìre mhath ìosal, tòisichidh mullach an lùb leudachaidh nas fhaide air adhart, agus thèid dàil a chuir air luach CT.
C: Ciamar a tha an dòigh dath eadar-dhealaichte bhon dòigh sgrùdaidh?
Freagairt: Modh dathCha bhith cuid de dhhathan flùraiseach, leithid SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, msaa, a’ leigeil a-mach solas leotha fhèin, ach bidh iad a’ leigeil a-mach flùraisean às deidh dhaibh a bhith ceangailte ris a’ chlais bheag de DNA dà-shreath.Mar sin, aig toiseach an ath-bhualadh PCR, chan urrainn don inneal an comharra flùraiseach a lorg.Nuair a ruigeas an t-ath-bhualadh an ìre leudachaidh annealing, thèid an dual dùbailte fhosgladh, agus tha dualan ùr air a cho-chur fo ghnìomhachd DNA polymerase, agus bidh am moileciuil flùraiseach a’ ceangal ris an dsDNA beag groove.Mar a bhios an àireamh de chuairtean PCR a’ dol am meud, tha barrachd is barrachd dhathan air an cur còmhla ri DNA dà-shreath, agus tha an comharra flùraiseach cuideachd air àrdachadh gu leantainneach.Tha an dòigh dath air a chleachdadh sa mhòr-chuid ann an rannsachadh saidheansail.
PS: Bi faiceallach nuair a bhios tu a’ dèanamh an deuchainn, feumaidh an dath a bhith air a chur còmhla ri DNA daonna, bi faiceallach a thionndadh gu bhith na neach flùraiseach.
Modh dath (clì) Modh sgrùdaidh (deas)
PS: Bi faiceallach nuair a bhios tu a’ dèanamh an deuchainn, feumaidh an dath a bhith air a chur còmhla ri DNA daonna, bi faiceallach a thionndadh gu bhith na neach flùraiseach.
SYBR Green Ⅰ a’ ceangal ri clais bheag DNA
Modh sgrùdaidhIs e probe Taqman an probe hydrolysis as cumanta.Tha buidheann flùraiseach aig deireadh 5 ′ den probe, mar as trice FAM, agus tha an probe fhèin na shreath a tha co-chosmhail ris a’ ghine targaid.Tha buidheann quenching fluorescent aig a’ cheann 3 ′.A rèir prionnsapal gluasad lùth ath-shuidheachadh fluorescence (gluasad lùth ath-shuidheachadh Förster, FRET), nuair a tha am buidheann fluorescent neach-aithris (moileciuil fluorescent tabhartaiche) agus a ’bhuidheann fluorescent quenching (receptor fluorescent moileciuil) air bhioran Nuair a tha an speactra a’ dol thairis air agus an astar glè dhlùth (7-10nm), faodaidh excitation an moileciuil fluoresc a bhith a’ gabhail ris a’ mholacile fèin-ghluasadach. lagachadh.Mar sin, aig toiseach an ath-bhualadh PCR, nuair a tha an probe an-asgaidh agus slàn san t-siostam, cha bhith a’ bhuidheann fluorescent neach-aithris a ’leigeil a-mach fluorescence.Nuair a bhios tu a’ annealadh, bidh am primer agus an probe a’ ceangal ris an teamplaid.Aig ìre an leudachaidh, bidh am polymerase an-còmhnaidh a’ co-chur slabhraidhean ùra.Tha gnìomhachd exonuclease 5′-3′ aig DNA polymerase.Nuair a ruigeas e an probe, bidh an DNA polymerase a’ uisgeachadh an probe bhon teamplaid, a’ dealachadh buidheann flùraiseach an neach-aithris bhon bhuidheann fluorescent quencher, agus a’ leigeil ma sgaoil an comharra flùraiseach.Leis gu bheil dàimh aon-ri-aon eadar an probe agus an teamplaid, tha an dòigh sgrùdaidh nas fheàrr na an dòigh dath a thaobh cruinneas agus cugallachd an deuchainn.Tha an dòigh sgrùdaidh air a chleachdadh sa mhòr-chuid ann am breithneachadh.
C: Dè a th' ann an àireamhachadh iomlan?Dè a th’ ann an àireamhachadh coimeasach?
Freagairt: Tha àireamhachadh iomlan a’ toirt iomradh air obrachadh a-mach àireamh leth-bhreac tùsail an t-sampall a thèid a dhearbhadh le qPCR, leithid cia mheud bhìoras HBV a tha ann an 1ml de fhuil.Is e an toradh a gheibhear le tomhas coimeasach an t-atharrachadh anns an ìre de ghine targaid ann an sampall sònraichte an coimeas ri sampall iomraidh eile, agus tha an abairt gine air a riaghladh suas no air a riaghladh sìos.
C: An toir an ìre de tharraing RNA, èifeachdas tar-sgrìobhaidh air ais, agus èifeachdas leudachaidh buaidh air toraidhean deuchainneach?
C: An toir stòradh sampall, ath-bheachdan às-tharraing, ath-bheachdan tar-chuir air ais, agus stuthan consum tar-chuir solais buaidh air toraidhean deuchainneach?
C: Dè an dòigh as urrainn an dàta deuchainneach a cheartachadh?
A thaobh nan cùisean sin, bheir sinn cunntas mionaideach orra anns na h-earrannan adhartach agus adhartach gu h-ìosal.
2. Eòlas adhartach
A thaobh PCR cainneachdail fluorescent fìor-ùine, feumaidh sinn aithneachadh gu bheil na mìltean de phàipearan rannsachaidh saidheansail air am foillseachadh gach bliadhna, agus am measg sin chan e àireamh bheag a th’ ann an teicneòlas cainneachdail PCR.
Mura h-eil ìre cumanta ann airson an deuchainn cainneachdail PCR a thomhas, faodaidh na toraidhean a bhith eadar-dhealaichte.Airson an aon ghine den aon ghnè, leis an aon dòigh giollachd, bidh na toraidhean lorg cuideachd ag atharrachadh gu farsaing, agus bidh e duilich dha daoine nach maireann na h-aon toraidhean ath-aithris.Thusa Chan eil fios aig duine dè tha ceart agus dè tha ceàrr.
A bheil seo a’ ciallachadh gur e teicneòlas meallta no teicneòlas neo-earbsach a th’ ann am PCR cainneachdail fluorescent?Chan e, is ann air sgàth gu bheil PCR cainneachdail fluorescent nas mothachaile agus nas cruinne, agus bheir gnìomhachd beag ceàrr toraidhean gu tur mu choinneamh.Tha call beag mìle air falbh.Faodaidh ùghdar an artaigil a bhith air a chràdh a-rithist leis an luchd-sgrùdaidh.Aig an aon àm, tha e duilich do luchd-sgrùdaidh na h-iris taghadh bho dhiofar thoraidhean deuchainneach.
Gu h-iomlan, a ’nochdadh dìth co-aontachd ann an deuchainnean PCR fìor-ùine.Gus seo a dhèanamh, thòisich àrd luchd-saidheans sa ghnìomhachas a 'cruthachadh inbhean,ag iarraidh air luchd-com-pàirt mion-fhiosrachadh deuchainneach agus giollachd dàta riatanach a thoirt seachad (a’ toirt a-steach dàta riatanach) san artaigil gus na h-inbhean sin a choileanadh.
Faodaidh luchd-sgrùdaidh measadh a dhèanamh air càileachd an deuchainn le bhith a 'leughadh an fhiosrachaidh seo;faodaidh luchd-leughaidh san àm ri teachd seo a chleachdadh cuideachd gus an deuchainn a dhèanamh a-rithist no an deuchainn a leasachadh.An uairsin tha na toraidhean deuchainneach a gheibhear san dòigh seo làn fiosrachaidh, de chàileachd àrd, agus faodar an cleachdadh.
MIBBI (Fiosrachadh as ìsle airson Sgrùdaidhean Bith-eòlasach agus Bith-mheidigeach -http://www.mibbi.org) thàinig e gu bith.Tha MIBBI na phròiseact a bheir seachad inbhean airson deuchainnean.Tha e air fhoillseachadh ann an nàdar.Tha am pròiseact seo ag amas air diofar dheuchainnean bith-eòlasach, a’ gabhail a-steach bith-eòlas cealla, Microarray, qPCR air a bheil sinn a’ dol a dheasbad a-nis, msaa, agus a’ solarachadh airson gach seòrsa deuchainn nuair a bhios sinn a’ cur a-steach làmh-sgrìobhainnean.Bu chòir am fiosrachadh sin a thoirt seachad fad na h-ùine.
Ann am pròiseact MIBBI, tha dà artaigil co-cheangailte ri PCR cainneachdail fluorescent, is e sin:
· RDML (Cànan Comharrachaidh Dàta PCR fìor-ùine) - cànan structaraichte agus stiùireadh aithris airson dàta PCR cainneachdail fìor-ùine;
·MIQE (Fiosrachadh as ìsle airson Foillseachadh Deuchainnean PCR Cainnteach fìor-ùine) - fiosrachadh as ìsle airson artaigilean fhoillseachadh mu dheuchainnean PCR cainneachdail fìor-ùine.
An toiseach, bruidhnidh sinn mu RDML, an sònrachadh briathrachais.
Mura h-eil mìneachadh àbhaisteach ann airson a h-uile dad, tha e do-dhèanta leantainn air adhart leis an deasbad, agus is e sin as coireach gu bheil mìneachadh teirmean cho cudromach san deuchainn.
Tha am briathrachas a chaidh a chleachdadh anns an deuchainn cainneachdail PCR a’ toirt a-steach an t-susbaint a leanas.Tha QIAGEN air an geàrr-chunntas as fheàrr a dhèanamh dhuinn.Tha na leanas uile tiorambathar .
Curve leudachaidh
Tha an lùb leudachaidh a’ toirt iomradh air an lùb a chaidh a dhèanamh tron phròiseas PCR, leis an àireamh cearcall mar an abscissa agus an dian fluorescence fìor-ùine rè an ath-bhualadh mar an òrdugh.
Bu chòir na feartan a leanas a bhith aig lùb leudachaidh sàr-mhath: tha am bun-loidhne rèidh no beagan air a dhol sìos, agus chan eil gluasad follaiseach ann;tha puing inflection an lùb soilleir, agus tha leathad na h-ìre eas-chruthach a rèir èifeachdas leudachaidh.Mar as motha an leathad, is ann as àirde an èifeachdas leudachaidh;an lùb leudachaidh iomlan Tha an co-shìnteachd math, a’ nochdadh gu bheil èifeachdas leudachaidh gach tiùba coltach;tha an ìre eas-chruthach den lùb leudachaidh de shamhlaichean dùmhlachd ìosal follaiseach.
Bun-loidhne (Bun-loidhne)
Is e am bun-loidhne ìre fuaim a’ chuairt thràth, mar as trice air a thomhas eadar an 3mh agus an 15mh cearcall, leis nach urrainnear an àrdachadh luach fluorescence a dh’ adhbhraich an toradh leudachaidh a lorg rè na h-ùine seo.Faodaidh an àireamh de chuairtean a thathar a’ cleachdadh airson a’ bhun-loidhne obrachadh a-mach a bhith eadar-dhealaichte agus dh’ fhaodadh gum feumar a lughdachadh ma thèid meudan teamplaid àrd a chleachdadh no ma tha ìre faireachdainn a’ ghine targaid àrd.
Le bhith a’ suidheachadh na bun-loidhne feumar coimhead air dàta fluorescence bhon lùb leudachaidh sreathach.Tha a’ bhun-loidhne air a shuidheachadh gus am bi fàs an lùb leudachaidh a’ tòiseachadh le àireamh cearcall nas motha na an àireamh mullach cearcall bun-loidhne.Feumar bun-loidhne a shuidheachadh leotha fhèin airson gach sreath targaid.Feumar na luachan fluorescence cuibheasach a chaidh a lorg anns na cearcallan tràtha a thoirt air falbh bho na luachan fluorescence a gheibhear anns na toraidhean àrdaichte.Tha na dreachan as ùire de dhiofar bhathar-bog PCR Real-Time a’ ceadachadh optimization fèin-ghluasadach de shuidheachaidhean bun-loidhne airson sampallan fa leth.
Anns a 'chiad beagan chuairtean de fhreagairt leudachaidh PCR, chan eil an comharra flùraiseach ag atharrachadh mòran.Canar a’ bhun-loidhne ri bhith a’ tighinn faisg air loidhne dhìreach, ach ma choimheadas sinn gu dlùth air a’ chiad beagan chuairtean, chì sinn gur ann taobh a-staigh na bun-loidhne a tha na tha a’ tachairt san dealbh gu h-ìosal.
Cùl-fhiosrachadh Tha cùl-fhiosrachadh a’ toirt iomradh air
an luach flùraiseach neo-shònraichte san fhreagairt .Mar eisimpleir: quenchence fluorescence neo-èifeachdach;no àireamh mhòr de theamplaidean DNA le sreathan dùbailte mar thoradh air cleachdadh SYBR Green.Tha na pàirtean cùl-fhiosrachaidh den chomharra air an toirt air falbh gu matamataigeach leis an algairim bathar-bog PCR Real-Time.
Comharra neach-aithris
Tha comharra neach-aithris a ’toirt iomradh air a’ chomharra flùraiseach a chaidh a chruthachadh le SYBR Green no probes sreath-sònraichte le bileagan fluorescent rè PCR Real-Time.
Comharradh Neach-aithris àbhaisteach (RN)
Tha RN a’ toirt iomradh air dian fluorescence dath an neach-aithris air a roinn le dian fluorescence an dath iomraidh fulangach air a thomhas aig gach cearcall.
Dath iomraidh fulangach
Ann an cuid de PCRan fìor-ùine,tha an dath flùraiseach ROX air a chleachdadh mar iomradh a-staigh gus an comharra flùraiseach a dhèanamh àbhaisteach.Bidh e a’ ceartachadh airson atharrachaidhean mar thoradh air pìobaireachd mearachdach, suidheachadh an tobair, agus caochlaidhean flùraiseach air stèidh tobar.
An stairsneach fluorescence (stairsnich)
air atharrachadh os cionn an luach cùl-fhiosrachaidh agus gu math nas ìsle na luach àrdchlàr an lùb leudachaidh.Feumaidh e laighe ann an roinn sreathach an lùb leudachaidh, a’ riochdachadh an raon log-loidhneach de lorg PCR.Bu chòir targaidean a shuidheachadh anns an t-sealladh lùb leudachaidh log gus am bi e furasta an ìre log-loidhne de PCR aithneachadh.Ma tha grunn ghinean targaid ann am PCR Real-Time, feumar an stairsneach a shuidheachadh airson gach targaid .San fharsaingeachd, thathas a’ cleachdadh an comharra fluorescence anns a’ chiad 15 cearcallan de ath-bhualadh PCR mar chomharradh cùl-raon fluorescence, agus tha an stairsneach fluorescence 10 tursan nas àirde na an claonadh àbhaisteach de chomharran fluorescence anns a’ chiad 3 gu 15 cearcallan de PCR, agus tha an stairsneach flùraiseach air a shuidheachadh anns an ìre exponential de leudachadh PCR.San fharsaingeachd, tha an stairsneach flùraiseach aig gach inneal mus tèid a chleachdadh.
Slighe Rothaireachd (CT) no Rubha Tarsainn (CP)
An cearcall aig a bheil an lùb leudachaidh a’ dol tarsainn na stairsnich (ie, an ìre aig a bheil lorg fluorescence a’ dol am meud gu mòr).Faodaidh CT a bhith na bloigh agus faodar an àireamh de theamplaid tòiseachaidh a thomhas.Tha an luach CT a’ riochdachadh na h-àireamh de chuairtean a dh’ aithnichear nuair a ruigeas an comharra flùraiseach anns gach tiùb freagairt PCR an stairsneach stèidhichte.Tha dàimh sreathach eadar luach CT gach teamplaid agus logarithm àireamh leth-bhreac tùsail an teamplaid, annas àirde an àireamh leth-bhreac tùsail, mar as lugha an luach CT, agus a chaochladh.Faodar lùb àbhaisteach a dhèanamh le bhith a’ cleachdadh inbhe le àireamh leth-bhreac aithnichte, far a bheil an abscissa a’ riochdachadh an luach CT, agus an t-òrdugh a’ riochdachadh logarithm a’ chiad leth-bhreac.Mar sin, fhad ‘s a gheibhear luach CT an t-sampall neo-aithnichte, faodar àireamh leth-bhreac tùsail an t-sampall a thomhas bhon lùb àbhaisteach.
Luach ΔCT
Tha luach ΔCT a’ toirt cunntas airan eadar-dhealachadh eadar an gine targaid agus an luach CT gine iomraidh endogenous co-fhreagarrach, leithid gine gleidhidh taighe, agus tha e air a chleachdadh gus an ìre de theamplaid a thathar a’ cleachdadh a dhèanamh àbhaisteach:
⇒ΔCT = CT (gine targaid) - CT (gine iomraidh endogenous)
ΔΔCT Luach
Tha an luach ΔΔCT a’ toirt cunntas air an eadar-dhealachadh eadar luach cuibheasach ΔΔCT de shampall ùidh (me, ceallan brosnaichte) agus luach ΔΔCT cuibheasach sampall iomraidh (me, ceallan neo-bhrosnaichte).Canar an sampall calibration ris an sampall iomraidh cuideachd agus tha a h-uile sampall eile air a dhèanamh àbhaisteach dha seo airson tomhas coimeasach:
⇒ΔΔCT = cuibheasachd ΔCT (sampall ùidh) - cuibheasach ΔCT (sampall iomraidh)
Ginean iomraidh endogenous (ginean iomraidh endogenous)
Chan eil na h-ìrean faireachdainn de ghinean iomraidh endogenous, leithid ginean cumail-taighe (ginean cumail-taighe), eadar-dhealaichte eadar sampallan.Le bhith a’ dèanamh coimeas eadar luachan CT a’ ghine iomraidh ris a’ ghine targaid, leigidh sin ìre faireachdainn a’ ghine targaid a bhith àbhaisteach a rèir na tha de chur-a-steach RNA no cDNA (faic an earrann air luachan ΔCT gu h-àrd).
Tha ginean iomraidh taobh a-staigh ceart airsontruailleadh RNA a dh’ fhaodadh a bhith ann no làthaireachd luchd-bacadh enzyme ann an sampallan RNA, a bharrachd air atharrachaidhean ann an susbaint RNA, èifeachdas tar-chuir air ais, faighinn seachad air searbhag niuclasach, agus làimhseachadh sampall.Gus an gine(an) iomraidh as fheàrr a thaghadh, dh’atharraich sinn an algairim gus leigeil leis an iomradh as fheàrr a thaghadh a rèir an t-suidheachaidh deuchainneach.
Smachd a-staigh
Sreath smachd a tha air a mheudachadh san aon fhreagairt ris an t-sreath targaid agus air a sgrùdadh le probe eadar-dhealaichte (ie, coileanadh PCR dà-fhillte).Bithear a’ cleachdadh smachdan a-staigh gu tric gus cuir às do leudachaidhean a dh’ fhàillig, leithid nuair nach lorgar an t-sreath targaid.
Sampall calibration
Sampall iomraidh (mar eisimpleir, RNA air a ghlanadh bho loidhne cealla no clò) air a chleachdadh ann an tomhas coimeasach gus coimeas a dhèanamh eadar gach sampall eile gus ìre faireachdainn dàimheach gine a dhearbhadh.Faodaidh an sampall calibration a bhith na shampall sam bith, ach mar as trice is e smachd a th’ ann (mar eisimpleir, sampall gun làimhseachadh no sampall bho àm neoni den deuchainn).
Smachdan adhartach
cleachdadh ath-bheachdan smachd lemeudan aithnichte de theamplaidean.Bithear a’ cleachdadh smachdan adhartach gu tric gus dèanamh cinnteach gu bheil seata primer no seata probe primer ag obair gu ceart agus gu bheil am freagairt air a stèidheachadh ceart.
Gun smachd teamplaid (NTC)
Freagairt smachd anns a bheil na pàirtean riatanach uile den fhreagairt leudachaidh ach a-mhàin an teamplaid, a bhios mar as trice air a chuir na àite le uisge.Faodaidh cleachdadh NTC an truailleadh a tha air adhbhrachadh le truailleadh reagent no DNA cèin a lorg, mar sin a’ dèanamh cinnteach à dearbhteachd agus earbsachd an dàta lorgaidh.Tha leudachadh air smachd NTC a’ nochdadh truailleadh.
Gun smachd RT (NRT)
Faodaidh pròiseas às-tharraing RNA a bhith a’ toirt a-steach DNA genomic air fhàgail, a tha gu math cronail agus a tha na neach a tha an sàs ann a bhith a’ toirt buaidh air càileachd dàta agus nàmhaid nàdarra qPCR, agus mar sin nuair a thathar a’ dealbhadh dheuchainnean, feumar a dhealbhadh gus lorg RNA a mheudachadh a-mhàin.Tha dà dhòigh ann, is e aon a bhith a’ dealbhadh primers thairis air introns, is e an tè eile DNA a thoirt air falbh gu tur, dè am fear as fheàrr, a thèid a dheasbad nas fhaide air adhart.Tha an smachd NTR na sgàthan draoidheachd gus truailleadh DNA a lorg.Ma tha leudachadh ann, tha e a’ ciallachadh gu bheil truailleadh ann.
Inbhean
Is e inbhean sampaill de àireamh cruinneachaidh no leth-bhreac aithnichte a thathas a’ cleachdadh gus lùb àbhaisteach a thogail.Gus dèanamh cinnteach à seasmhachd na h-inbhe, mar as trice bidh a’ chriomag gine air a chlonadh a-steach don plasmid agus air a chleachdadh mar an inbhe.
An lùb àbhaisteach
mar as trice air a lagachadh ann an co-dhiù 5 caisead dùmhlachd leis an toradh àbhaisteach a rèir a’ cho-mheas dùblachaidh, agus tha 5 puingean air an tarraing ann an co-chomharran luach CT agus àireamh leth-bhreac, agus tha na puingean ceangailte gus loidhne a chruthachadh gus lùb àbhaisteach a ghineadh.Airson gach lùb àbhaisteach, feumar sgrùdadh a dhèanamh air dligheachd.Tha luach an leathad a’ tuiteam eadar -3.3 agus -3.8, agus tha gach dùmhlachd air a dhèanamh ann an trì-fhillte.Bu chòir puingean a tha gu math eadar-dhealaichte bho phuingean eile a thoirt air falbh.Tha luach CT an t-sampall a tha ri dhearbhadh air a thoirt a-steach don lùb àbhaisteach, agus faodar ìre faireachdainn an t-sampall a thèid a dhearbhadh a thomhas.
Tha luach CT an t-sampall a tha ri dhearbhadh air a thoirt a-steach don lùb àbhaisteach, agus faodar àireamh leth-bhreac tùsail an t-sampall a thèid a dhearbhadh a thomhas.
Èifeachdas agus leathad
Tha leathad an lùb àbhaisteach a’ riochdachadh èifeachdas PCR fìor-ùine.
· Tha leathad de -3.322 a’ nochdadh gu bheil èifeachdas leudachaidh PCR 1, no 100% èifeachdach, agus gu bheil an ìre de thoradh PCR a’ dùblachadh aig gach cearcall.
· Tha leathad nas lugha na -3.322 (me, -3.8) a’ nochdadh èifeachdas PCR
· Tha leathad nas motha na -3.322 (me, -3.0) a’ nochdadh gu bheil coltas gu bheil èifeachdas PCR nas àirde na 100%, rud a tha neònach, ciamar a dh’ fhaodadh aon chearcall de PCR barrachd air a dhà uiread an toradh àrdaichte a ghineadh?Tha an suidheachadh seo a’ tachairt anns an ìre neo-shreathach den fhreagairt PCR, is e sin, tha tòrr meudachaidh neo-shònraichte ann.
lùb leaghaidh
Às deidh an leudachadh qPCR a chrìochnachadh, tha an toradh PCR air a theasachadh.Mar a bhios an teòthachd ag èirigh, bidh an toradh leudachaidh dà-shreath a ’leaghadh mean air mhean, a’ leantainn gu lùghdachadh ann an dian fluorescence.Nuair a ruigear teòthachd sònraichte (Tm), leaghaidh àireamh mhòr de thoraidhean.Bidh fluorescence a’ tuiteam gu mòr.Tha luachan Tm eadar-dhealaichte aig diofar thoraidhean PCR agus teòthachd leaghaidh eadar-dhealaichte, gus an tèid sònrachas PCR a chomharrachadh.
lùb leaghaidh (lùb derivative)
Tha an lùb leaghaidh air a thoirt a-mach gus mapa stùc a chruthachadh, a sheallas suidheachadh mìrean toraidh PCR ann an dòigh nas intuitive.Leis gur e an teòthachd leaghaidh luach Tm a’ chriomag DNA, faodar cuid de pharaimearan a bheir buaidh air luach Tm a’ chriomag DNA a bhreithneachadh, leithid meud criomag, susbaint GC, msaa.tha fad an toraidh leudaichte anns an raon de 80-300bp, agus mar sin bu chòir an teòthachd leaghaidh a bhith eadar 80 ° C agus 90 ° C.
Mìneachadh air an lùb leaghaidh: Ma tha an aon phrìomh stùc a’ nochdadh eadar 80 ° C-90 ° C, tha e a’ ciallachadh gu bheil am PCR cainneachdail fluorescent foirfe;ma tha am prìomh stùc a’ nochdadh eadar 80 ° C-90 ° C agus stùcan measgaichte a’ nochdadh fo 80 ° C, thathas a’ beachdachadh gu bunaiteach air an primer dimer.Faodaidh tu feuchainn ris an teòthachd annealing àrdachadh gus fuasgladh fhaighinn air;ma tha am prìomh stùc a’ nochdadh eadar 80 ° C-90 ° C, agus an stùc measgaichte a’ nochdadh a-rithist nuair a dh’ èiricheas an teòthachd, thathas den bheachd gu bunaiteach gu bheil truailleadh DNA ann, agus feumar DNA a thoirt air falbh aig a’ chiad ìre den deuchainn.
Gu dearbh, tha cuid de shuidheachaidhean neo-àbhaisteach ann fhathast, a thèid a bhriseadh sìos aon às deidh aon gu h-ìosal.
3. Eòlas adhartach
Gus qPCR a dhèanamh, feumaidh mi MIQE a ràdh,Fiosrachadh as ìsleairson foillseachadhCainnteachPCR fìor-ùineDeuchainnean - am fiosrachadh as lugha airson artaigilean fhoillseachadh mu PCR cainneachdail fìor-ùinedeuchainnean.Gus tuigse a h-uile duine a dhèanamh nas sìmplidhe, nì sinn nas sìmplidhe air a 'phrìomh shusbaint.
Faodaidh tu teacsa tùsail MIQE a sgrùdadh air an eadar-lìn, agus is e an rud as cudromaiche gu bheil e ag òrdachadh anliosta sgrùdaidh dàta a dh’ fheumar a thoirt seachad nuair a thathar a’ foillseachadh artaigil .
Faodaidh luchd-sgrùdaidh measadh a dhèanamh air càileachd an deuchainn le bhith a 'leughadh an fhiosrachaidh seo;faodaidh luchd-leughaidh san àm ri teachd seo a chleachdadh cuideachd gus an deuchainn a dhèanamh a-rithist no a leasachadh.
'S fhiach toirt fa-near gu bheil anns an liosta seo, tha cudromachd gach liosta air a chomharrachadh le E no D fa leth.Dè a tha e a’ ciallachadh?E: fiosrachadh riatanach (feumar a chuir a-steach);D: fiosrachadh ion-mhiannaichte (thoir seachad cho mòr 'sa ghabhas).
MIQE (1) - Dealbhadh Deuchainneach
Cha bhi fios aig mòran de na scumbags a chuir crìoch air an dìon às deidh dhaibh crìoch a chur air an cuid ionnsachaidh ceumnachaidh mar a dhealbhaicheas iad deuchainn gu neo-eisimeileach, fosgail na leabhraichean notaichean aca, agus dèan na tha an tidsear ag iarraidh orra a dhèanamh.Mar thoradh air an sin, cha robh an dealbhadh deuchainneach cruaidh, agus thuirt roinn deasachaidh na h-iris gu robh iad airson an dealbh seo agus an dealbh sin a dhèanamh suas, agus mar sin rinn iad e ann an daze.Seo mar a tha na balgan-buachair air an dèanamh!
Nas fhaisge air an dachaigh, is e a’ chiad phrionnsapal den deuchainn a bhith a’ dearbhadhcho cruaidh sa tha an loidsig deuchainneach.Is e an rud as bunaitiche an dealbhadh deuchainneach, agus is e an rud as cudromaiche mun dealbhadh deuchainneach mar a shuidhicheas tu an sampall targaid, sampall iomraidh (smachd), agus an àireamh de ath-aithris, gus an tèid iomradh a thoirt air an dàta deuchainneach, coimeasach agus cinnteach.
An sampall targaida’ toirt iomradh air an sampall a dh’ fheumas sinn an gine targaid a lorg às deidh làimhseachadh sònraichte.An sampall iomraidhan sampall gun làimhseachadh sam bith, ris an canar gu tric seòrsa fiadhaich ann am bith-eòlas.
Ath-bhualaidhean deuchainneachair leth cudromach.San fharsaingeachd, feumaidh an àireamh de ath-bhualaidhean ìmpidheach a bhith nas motha na trì.Feumar eadar-dhealachadh a dhèanamh air dè a th’ ann an ath-riochdachadh bith-eòlasach agus dè a th’ ann an ath-riochdachadh teignigeach.
Ath-bheachdan bith-eòlasach: An aon deuchainn dearbhaidh air a dhèanamh le diofar stuthan (ùine, planntrais, batches, lannan freagairt).
Dùblachadh bith-eòlasach
Gabhamaid làimhseachadh puinnsean-bhiastagan mar eisimpleir.Tha sinn airson puinnseanan a spìonadh air na trì planntaichean aig ABC, agus an uairsin tha na trì planntaichean aig ABC nan trì ath-riochdachadh bith-eòlasach, agus is iadsan an aon deuchainn dearbhaidh a chaidh a dhèanamh le diofar stuthan.Ach mar dheuchainn, tha feum air smachd gu cinnteach, gus an urrainn dhuinn aon de na meuran de phlannt A a spìonadh gus buidheann deuchainneach de phlannt A a chruthachadh, agus gun a bhith a ’frasadh na meuran eile de phlannt A gus buidheann smachd a chruthachadh.Dèan an aon rud airson B agus C.
Ath-bhualaidhean Teicnigeach (Mac-samhail Teicnigeach): Is e deuchainn a th’ ann a-rithist a chaidh a dhealbhadh gus mearachdan a dh’ adhbhraicheas obrachadh a sheachnadh, a tha dha-rìribh na tholl dùblaichte air a ghabhail a-steach san aon stuth.Feumaidh suidheachaidhean ath-aithris a bhith aig gach làimhseachadh agus smachd (co-dhiù trì) den ghine targaid agus den ghine iomraidh a-staigh.
Ath-aithris theicnigeach
Gabh am piobar air a làimhseachadh le puinnseanan mar eisimpleir a-rithist.Airson a’ bhuidheann deuchainneach de phlannt A, rinn sinn trì tuill PCR de 1, 2, agus 3 airson a ghine targaid agus gine iomraidh a-staigh fa leth, gus a’ chuibheasachd a ghabhail às deidh an lorg.Airson smachd air planntrais A tha buidhnean cuideachd air an làimhseachadh san aon dòigh.San aon dòigh, dèan an aon làimhseachadh airson lusan B agus C.Is e ath-aithris theicnigeach a tha seo.
Is fhiach sin a thoirt fa-nearIs e an rud a thig a-steach do na staitistig an ath-aithris bith-eòlasach, agus is e an ath-aithris theicnigeach a bhith a’ dèanamh deuchainn a bheil uinneanan air thuaiream sam bith sa phròiseas deuchainneach, gus na toraidhean deuchainneach a dhèanamh creidsinneach, is e sin, gus mearachdan a sheachnadh le bhith a’ toirt a’ chuibheasachd aca mar a chanas sinn gu tric.
Smachdan àicheil - NTC agus NRT
NTC (Smachd gun teamplaid), smachd gun teamplaid, air a chleachdadh gus dearbhadh a bheil an stuth deuchainneach air a thruailleadh.San fharsaingeachd, tha uisge air a chleachdadh mar theamplaid.Ma tha ath-bhualadh fluorescent ann, tha e a’ nochdadh gu bheil truailleadh searbhag niuclasach air tachairt san obair-lann.
Tha na truailleadh sin a’ tighinn bho: uisge neo-ghlan, ath-bheachdan gun teisteanas anns a bheil DNA endogenous, truailleadh primer, truailleadh uidheamachd obair-lann, truailleadh aerosol, msaa, feumar scavengers RNase agus luchd-bacadh RNase.Is e truailleadh aerosol an fheadhainn as duilghe a lorg.Smaoinich gu bheil an obair-lann agad coltach ri smog, le diofar searbhagan niuclasach crochte san adhar.
NRT (tar-sgrìobhadh gun chùl), an smachd gun ath-sgrìobhadh cùil, an RNA ath-sgrìobhaidh neo-chùil mar smachd àicheil, a tha na smachd air fuigheall gDNA.
Nuair a bhios tu a’ dèanamh abairt gine, thathas a’ lorg na tha de RNA le bhith a’ lorg na tha de cDNA às deidh tar-sgrìobhadh cùil.Ma tha fuigheall gDNA ann nuair a thèid RNA a ghlanadh, adhbharaichidh e mearachdan anns na toraidhean deuchainneach, leis gur e gDNA agus cDNA na fìor thoraidhean a gheibhear.Aig an ìre iomlan, chan e dìreach cDNA, feumar gDNA a thoirt air falbh gu tur nuair a thèid RNA a thoirt a-mach.
MIQE (2) - sampall fiosrachaidh
Tha am fiosrachadh sampall ris an canar a’ ciallachadh nuair a dh’ fhoillsicheas sinn artaigil mu qPCR, feumaidh sinn am fiosrachadh sampall a mhìneachadh gu soilleir, a tha na phàirt riatanach den artaigil.San aon dòigh, nuair a bhios sinn a’ giullachd shampaill, feumaidh sinn cuideachd ar gnìomhachd fhèin a riaghladh gus dèanamh cinnteach à dligheachd nan sampallan.
Chan eil anns an tuairisgeul air an sampall ach toradh, agus bu chòir dhuinn barrachd aire a thoirt do na stuthan a chaidh a thogail tron deuchainn gu lèir.
Taghadh de stuthan deuchainneach
Sampall fala - tagh fuil ùr, gun a bhith nas fhaide na 4 uairean.Samhlaidhean cealla - tagh ceallan ùra a chruinneachadh ann an ùine de dh'fhàs làidir.Feusag bheathaichean - Tagh clò ùr a tha a’ fàs gu làidir.Mìn-lusan - Tagh clò ùr, òg.
Feumaidh tu a bhith air mothachadh gu bheil prìomh fhacal anns na beagan sheantansan seo: fresh .
Airson na sampallan gu h-àrd, is e an uidheamachd as fheàrr, cosg-èifeachdach agus seasmhach air a’ mhargaidh pasgan Foregene, as urrainn an DNA agus RNA aca a thoirt a-mach gu sgiobalta agus gu furasta.
Kit Iomallach RNA Iomlan bheathaichean
Lusan Kit Iomallach Iomlan RNA
Lusan Kit Iomallach Iomlan RNA Plus
Stòradh stuthan deuchainneach
San fharsaingeachd, chan eil sinn a’ moladh sampallan a stòradh, ma cheadaicheas na cumhaichean.Ach, tha mòran charaidean ann nach urrainn deuchainnean a dhèanamh dìreach às deidh samplachadh, agus feumaidh cuid eadhon tancaichean nitrogen leaghaidh a ghiùlan chun raon airson samplachadh.
Airson an seòrsa seo de charaid dìcheallach, chan urrainn dhomh ach a ràdh nach eil thu a 'tuigsinn stuthan consum reagent.A-nis bidh mòran de chompanaidhean ath-ghnìomhach a ’toirt a-mach ath-bheachdan as urrainn sampallan RNA a stòradh aig teòthachd an t-seòmair, agus faodaidh tu roghnachadh an cleachdadh.Is e an dòigh stòraidh àbhaisteach stòradh nitrigin leaghaidh, a’ cleachdadh tanca beag nitrigin leaghaidh a tha furasta a ghiùlan.Às deidh an sampall a thoirt air ais chun obair-lann, stòraich e ann am fuaradair -80 ° C.
Airson deuchainnean anns a bheil RNA, feumar am prionnsapal sia-fhaclan a leantainn:teòthachd ìosal, gun enzymes,agusluath .
Tha bun-bheachd teòthachd ìosal furasta a thuigsinn;às aonais enzyman, tha RNase anns a h-uile àite san t-saoghal anns a bheil sinn a’ fuireach (air dhòigh eile bhiodh tu air do mharbhadh le HIV), agus mar sin mar a sheachnadh tu RNase nuair a bhios tu a’ dèanamh dheuchainnean tha e na bhun-bheachd glè chudromach;luath,Chan eil Kung Fu air an t-saoghal nach gabh a bhriseadh, chan urrainnear ach astar a bhriseadh.
Mar sin, ann an dòigh, mar as giorra an ùine às-tharraing, is ann as fheàrr a bhios am pasgan.Carson a thaForegene's kit cuideam a chur air astar, oir tha iad eòlach air gu math.
PS: Bidh cuid de chlann-nighean a’ dèanamh dheuchainnean gu faiceallach, ach chan eil iad cho math ri slam dunk às deidh grunn bhliadhnaichean de dh’ obair.Bidh iad a 'faireachdainn gu bheil Dia mì-chothromach, a' gearan mu dhaoine eile, agus a 'coimhead airson beatha.Gu dearbh, cha do thuig i e.Cha do dhìon e an RNA gu math, agus bha an cluicheadair slam dunk sùbailte.Nuair a bha e a’ dèanamh an deuchainn, smaoinich e gun cuireadh e crìoch air an slam dunk trì tursan, còig tursan, agus dà roinn, ach rinn e an deuchainn gu math.
Thoir an aire: Nas slaodaiche, barrachd chothroman air ionnsaigh RNase.Ciamar a thrèanadh tu fhèin airson a bhith luath?Chan eil dòigh ann, dìreach cleachd barrachd.
Airson diofar dheuchainnean agus diofar shamhlaichean, tha e fhathast riatanach barrachd litreachas a leughadh agus dòigh iomchaidh a thaghadh airson a ghiullachd.Airson a’ phròiseas cruinneachaidh is stòraidh sampaill, tha MIQE ag iarraidh gum feum e a bhith sgrìobhte gu soilleir anns a’ phàipear, gus an urrainn don luchd-sgrùdaidh ath-sgrùdadh a dhèanamh air earbsachd a’ phàipeir, agus tha e cuideachd goireasach dha na h-òigridh air an sàrachadh an deuchainn agad a dhèanamh a-rithist.
Ged a tha deuchainnean bith-eòlasach duilich, tha iad aig ìre àrd.Mura h-eil thu faiceallach, faodaidh tu an saoghal a thionndadh.Mar eisimpleir, a’ dèanamh SARS gu bhith na èiginn bith-cheimiceach, no a’ dèanamh rus tar-chinealach gus 1.3 billean neach a shàbhaladh.Tha an dealbh gu h-ìosal na dheuchainn cheimigeach, bu chòir dhut tuigsinn cho moiteil sa tha thu den rannsachadh agad dìreach le bhith a’ coimhead air a choltas coltach ri dick.Na dìochuimhnich e, na cuir dubh air.
MIQE (3) - às-tharraing searbhag niuclasach.
Is e tachartas mòr a th’ ann an às-tharraing searbhag niuclasach, agus bidh a h-uile deuchainn bith-eòlas moileciuil a’ tòiseachadh le às-tharraing searbhag niuclasach.An toiseach, dèanamaid lethbhreac de shusbaint MIQE air às-tharraing searbhag niuclasach.
A 'coimhead air an fhoirm seo, chan urrainn dhut fuireach air an uachdar.Is e dogma a th’ anns an fhoirm.Airson a bhith nad shàr oileanach, feumaidh tu faighneachd carson.Is e susbaint riatanach a’ chlàr seo: Tòirpurrachd, ionracas, cunbhalachd, agus meud às-tharraing RNA .
Tha a 'chiad phàirt denIs e pròiseas no ionnstramaid an ceum às-tharraing searbhag niuclasach.Ma chleachdas tu inneal-tarraing searbhag niuclasach fèin-ghluasadach airson toirt a-mach (adhartach, cuir fios thugam airson ceannach), feumaidh tu ainm modail an ionnstramaid a chomharrachadh.
An t-ainm a 'chit agus
dè an uidheam a chaidh a chleachdadh airson mion-fhiosrachadh an atharrachaidh, dè na h-ath-bheachdan sònraichte a chaidh a chur ris no dè na h-obraichean sònraichte a chaidh a dhèanamh a bu chòir a mhìneachadh gu soilleir gus an urrainn do dhaoine eile an deuchainn agad ath-aithris gu furasta.
Bidh cuid a 'cur cuid de dh' ath-bheachdan sònraichte nuair a bhios iad a 'toirt a-mach sampallan sònraichte, a' smaoineachadh gur e seo an armachd dìomhair aca agus nach innis iad do dhaoine eile.Fhad ‘s a chumas iad e dìomhair, bidh iad cuideachd a’ call an cothrom an artaigil agad a dhèanamh deàrrsadh.Na bi glic, feumaidh tu a bhith nas onarach na an seann dùthaich Zhang ann an rannsachadh saidheansail, ma tha thu airson a bhith glic, nì an artaigil thu gòrach.
feumaidh cuimhne a bhith agad air àireamh toraidh a’ phiseagnuair a dh’ òrduicheas tu am pasgan agus a sgrìobhas tu an artaigil.Mar as trice tha dà àireamh air a’ phiseag: cat - àireamh catalog (àireamh toraidh, àireamh artaigil), Lot - àireamh crann toraidh (Air a chleachdadh gus innse cò am baidse às an tàinig an toradh).
A bharrachd air an sin, bidh an àireamh CAS gu tric air a chleachdadh nuair a bhios tu ag òrdachadh ath-bheachdan bith-cheimiceach, agus nì mi mòr-chòrdte còmhla.Is e an àireamh CAS an àireamh a thug Comann Ceimigeach Ameireagaidh do gach droga ceimigeach ùr.San fharsaingeachd, tha trì àireamhan ceangailte le dash.Àireamh CAS Rushui: 7732-18-5.Gu tric bidh iomadh ailias aig ceimigean, ach tha an àireamh CAS gun samhail.Nuair a bhios tu ag òrdachadh cungaidh-leigheis, faodaidh tu sgrùdadh a dhèanamh air an àireamh CAS aige an-toiseach.
Nas fhaisge air an taigh, carson a dh'fheumas sinn na rudan sin a mhìneachadh gu soilleir?Gu dearbh, tha e cuideachd airson sgrùdadh a dhèanamh air càileachd às-tharraing RNA.Bidh cleachdadh ionnstramaidean agus innealan a’ dèanamh às-tharraing RNA nas cunbhalaiche.Chan eil sgèile às-tharraing nan deuchainn-lannan àbhaisteach mòr, agus gheibhear e le piseagan.
Mion-fhiosrachadh mu làimhseachadh DNase no RNase
Is e a’ cheist chudromach mu PCR cainneachdail fluorescent casg a chuir air truailleadh DNA, agus na bi a’ feuchainn a bheil truailleadh ann.Mar sin, tha e riatanach innse mun phròiseas a chleachd thu airson an DNA a phròiseasadh, gus sealltainn gu bheil an DNA sa phròiseas deuchainneach air a thoirt air falbh gu tur agus gu tur.air a riochdachadh le sgeama sgeamaichte.
Sgeama de RNA agus DNA
San fharsaingeachd, is e an dòigh air DNA a thoirt air falbh a bhith a’ làimhseachadh RNA le DNase às deidh às-tharraing.Ach, tha na dòighean sin gu math sean.Tha innealan às-tharraing RNA malairteach air a bhith comasach air DNA a thoirt air falbh tron phròiseas às-tharraing gun a bhith a’ cur DNase ris.Mar eisimpleir, sreath de chitichean bho Foregene .
Thoir an aire: Tha toirt air falbh DNA aig àm às-tharraing RNA na chlaidheamh dà-oireach cunnartach, a leudaicheas ùine obrachaidh às-tharraing RNA agus a mheudaicheas cunnart truailleadh RNA.Gu bunaiteach, tha e na mhalairt eadar toradh RNA agus purrachd.
A bharrachd air an sin, tha an ìre de DNase a chaidh a chur ris a’ cholbh assorption stèidhichte air silica glè bheag, agus feumar DNase àrd-inbhe a chleachdadh gus a’ bhuaidh a choileanadh.Chan urrainnear DNA neo-leasaichte a chnàmh gu sgiobalta agus gu tur.Is e seo deuchainn air ìre theicnigeach a’ cheannaiche.Gu dearbh, tha eadhon barrachd luchd-malairt neònach ann a tha a 'bòstadh gun gabh DNA a thoirt air falbh às aonais DNase.Faodar a ràdh gur e hooligan a th’ ann an neach sam bith a bhios a’ bragadh gun gabh DNA a thoirt air falbh gu tur às aonais DNase.Tha DNA na structar dà-shreath gu ìre mhath seasmhach, agus chan urrainnear a chuir às dìreach le bhith a’ bruidhinn agus a ’gàireachdainn.
Measadh truailleadh
modh measaidh: lorg electrophoresis, 1% agarose, 6V / cm, 15min, luchdachadh 1-3 ul
Mion-sgrùdadh cainneachdail aig searbhag niuclasach
mar as trice air a thomhas le bhith a’ cleachdadh spectrphotometer UV.Leig leam an-toiseach brìgh nan trì luachan aig OD260, OD280, agus OD230.
· OD260nm: Is e an tonn-tonn in-ghabhail den stùc sùghaidh as àirde de dh ’aigéad niuclasach, agus tha an luach tomhaiste as fheàrr a’ dol bho 0.1 gu 1.0.Mura h-eil, caolaich no dùmhlachd an sampall gus a thoirt taobh a-staigh raon.
· OD280nm: Is e seo an tonn in-ghabhail den stùc as àirde de phròtain agus stuthan phenolic.
· OD230nm: Is e seo an tonn in-ghabhail den stùc in-ghabhail as àirde de charbohydrates.
An ath rud, bruidhnidh sinn mu àite gach comharra.Airson A260, faodar a chleachdadh gus toradh searbhag niuclasach a thomhas.Nuair a bhios OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Airson purrachd, feumaidh sinn coimhead air na co-mheasan a chì sinn gu cumanta: OD260/280 agus OD260/230.
· DNA fìor-ghlan: Tha OD260/280 timcheall air co-ionann ri 1.8.Nuair a tha e nas àirde na 1.9, tha e a 'sealltainn gu bheil truailleadh RNA ann, agus nuair a tha e nas lugha na 1.6, tha e a' comharrachadh gu bheil truailleadh pròtain agus phenol ann.
· RNA fìor-ghlan: 1.7
· OD260/230: Ge bith an e DNA no RNA a th’ ann, is e an luach iomraidh 2.5.Nuair a tha e nas lugha na 2.0, tha e a 'sealltainn gu bheil siùcar, salann agus stuth organach truailleadh.
Ionracas RNA
Tha e glè chudromach ionracas RNA a thomhas.San fharsaingeachd, feumar deuchainn gel dì-nàdachadh RNA a dhèanamh gus faighinn a-mach a bheil an soilleireachd eadar 28S agus 18S RNA na dàimh dà-fhillte.Nuair a nochdas an treas còmhlan 5S, tha e a’ ciallachadh gu bheil an RNA air tòiseachadh a’ crìonadh, ach a-mhàin neo-dhruim-altachain.
Dàta airson measadh càileachd RNA: A bharrachd air na deuchainnean gu h-àrd, tha cuid de dheuchainnean ionnstramaid nas adhartaiche ann cuideachd a thaobh ionracas RNA, leithid deuchainn ionracas RQI air siostam electrophoresis fèin-ghluasadach Experion, a lorgas a bheil RNA air a lughdachadh gu neo-fhaicsinneach.
Ann an rannsachadh saidheansail, tha PCR cainneachdail fluorescent na choimeas eadar an gine targaid agus an gine iomraidh a-staigh.Mar sin, ann am pròiseas gleidheadh sampall RNA, às-tharraing RNA, msaa, is e am prìomh amas dèanamh cinnteach à ionracas RNA.
Tha e furasta mar a bheir ionracas RNA buaidh air a’ chothromachadh eadar an gine targaid agus an gine iomraidh a-staigh bhon fhigear gu h-ìosal.Leanaidh truailleadh gu neo-iomlanachd gine, ge bith an e neo-iomlanachd a’ ghine iomraidh a-staigh no neo-iomlanachd a’ ghine targaid, bheir e buaidh mhòr air an dàta.
Chan fhaod diagram sgeamach de ghine targaid agus gine iomraidh a bhith fìor
Deuchainn casg (co-dhiù a tha an luach CT air a chumail fodha fo dùmhlachd àrd no ìosal no suidheachaidhean eile)
A’ gabhail an fhigear seo mar eisimpleir, tha luachan Ct nan còig lùban mar a leanas.Tha cuairteachadh luachan CT eadar na lùban neo-chòmhnard, agus tha dàil air luachan Ct fo cho-chruinneachaidhean àrd is ìosal, a tha mar chùis casg PCR.
Prìomh phuing: Ann am pròiseas às-tharraing RNA, feumaidh sinn mì-thuigse a thrèigsinn agus feadhainn cheart a stèidheachadh.
Is e am beachd ceàrr: chan eil às-tharraing RNA ach a’ leantainn an toraidh, a’ smaoineachadh mar as motha an ìre de RNA a gheibhear, ’s ann as fheàrr.Gu dearbh, nuair a nì sinn tomhas, mura h-eil an àireamh de ghinean glè mhòr, chan fheum sinn mòran RNA.Tha an ìre de RNA a bheir thu a-mach nas motha na gu leòr.
Is e am bun-bheachd ceart:Bu chòir às-tharraing RNA purrachd, ionracas agus cunbhalachd a leantainn.Faodaidh purrachd dèanamh cinnteach nach tèid bacadh a chuir air an tar-sgrìobhadh cùil às deidh sin agus nach toir DNA buaidh air an dàta.Bidh ionracas a’ dèanamh cinnteach à cothromachadh sreathan targaid agus iomraidhean a-staigh.Bidh cunbhalachd a’ dèanamh cinnteach à luchdachadh sampall seasmhach.
MIQE (4) - tar-sgrìobhadh air ais
Mì-thuigse: an tòir air meud sampall nas àirde.
Bun-bheachd ceart: Lean air adhart le cunbhalachd (seasmhachd), ge bith dè an ìre de RNA a tha air a luchdachadh, tha èifeachdas tar-sgrìobhadh cùil fhathast cunbhalach, a’ dèanamh cinnteach gum faod eadar-dhealachaidhean ann an cDNA eadar-dhealachaidhean ann am mRNA a nochdadh.
Bidh sinn a’ mìneachadh a’ phròiseis seo le diagram sgeamach:
Diagram sgeamach de èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil, na bi fìor
An toiseach, feumaidh sinn an eadar-dhealachadh eadar am pròiseas tar-sgrìobhaidh cùil agus am pròiseas PCR a thuigsinn.Bidh PCR a’ dol tro iomadh pròiseas teasachaidh agus annealing, agus bidh a’ chriomag targaid a’ fàs gu h-obann;ged nach eil am pròiseas seo aig tar-sgrìobhadh air ais, is urrainn dhuinn smaoineachadh gu bheil ath-sgrìobhadh air ais aon-ri-aon Rè a’ phròiseas ath-riochdachadh, na h-uimhir de phìosan RNA
Leis gu bheil na h-uimhir de phìosan fiosrachaidh cDNA ann, bu chòir a thuigsinn ron àm seo, leis gu bheil pìosan mòra is beaga air an ath-sgrìobhadh air ais, agus tha e do-dhèanta fòcas a chuir air aon chriomag.Agus leis gu bheil an ìre de RNA an ìre mhath beag, tha an ìre de cDNA a gheibhear cuideachd an ìre mhath beag, eu-coltach ri PCR, aig a bheil buaidh leudachaidh, agus mar sin tha e do-dhèanta gu bunaiteach a lorg.
Toraidhean electrophoresis cDNA
San dàrna h-àite, mas fheàrr, bithear a’ dèanamh tar-sgrìobhadh air ais aon-ri-aon, ach chan urrainn dha tar-sgrìobhadh air ais bho chompanaidh sam bith a’ bhuaidh seo a choileanadh.Gu bunaiteach, tha èifeachdas a’ mhòr-chuid de ath-sgrìobhaidhean cùil a’ dol eadar 30-50%.Ma tha seo fìor, b’ fheàrr leinn èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil an ìre mhath seasmhach, agus is e sin a tha sinn airson fhaicinn san fhigear: gheibh 3 RNAn 2 cDNA, gheibh 6 RNAn 4 cDNAn, mar sin ge bith dè an ìre de shampall a tha air a luchdachadh, tha an èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil gu ìre mhath seasmhach.Chan eil sinn airson an suidheachadh fhaicinn far a bheil èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil neo-sheasmhach agus dùmhlachd àrd air a bhacadh.
Mar sin, ciamar a nì thu dearbhadh a bheil an èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil seasmhach?Tha an dòigh gu math sìmplidh, cha leig thu leas ach deuchainn coimeas a dhèanamh: tha aon ann airson ath-sgrìobhadh a thionndadh gu cDNA às deidh dùblachadh caolachadh RNA a dhùblachadh, agus am fear eile gus dùblachadh dùblachadh a dhèanamh às deidh ath-sgrìobhadh gu cDNA air ais, agus an uairsin dèan qPCR gus an leathad a fhuaireadh fhaicinn A bheil e cunbhalach.Mar phrìomh oileanach, bu chòir dhut a thuigsinn ann an diogan.Mar a chithear gu h-ìosal:
Lùghdachadh RNA agus cDNA gus dearbhadh a bheil èifeachdas tar-sgrìobhadh cùil seasmhach
Cuir air ais tar-sgrìobhadh agus pasgan
Ciamar as urrainn dha PCR cainneachdail fluorescent foirfe transcriptase agus pasgan cùil sàr-mhath a bhith aca.Tha transcriptase cùil air a roinn gu ìre mhòr ann an dà sheòrsa a rèir an stòr, AMV noM-MLV, agus tha an coileanadh co-ionann ris an fhear a chithear sa chlàr.
Gnìomhachd RNase H
Is e RNase H Ribonuclease H, is e an t-ainm Sìneach ribonuclease H, a tha na endoribonuclease a dh’ fhaodas RNA a uisgeachadh gu sònraichte anns an t-sreath hybrid DNA-RNA.Chan urrainn dha RNase H na bannan phosphodiester a uisgeachadh ann an DNA no RNA aon-shreath no dà-shreath, is e sin, chan urrainn dha DNA no RNA aon-shreath no dà-shreath a chnàmh.Mar as trice air a chleachdadh ann an synthesis an dàrna sreath de cDNA.
'S e rud neònach a th' ann.Tha sinn ag ràdh gu bheil gnìomhachd RNase H aig transcriptase air ais, chan e gu bheil RNase H ann an transcriptase cùil, agus is dòcha nach bi e comasach RNase H a sgaradh bho transcriptase cùil, is dòcha air sgàth co-chòrdadh bhuidhnean sònraichte ann an transcriptase cùil Tha an gnìomhachd seo air adhbhrachadh leis an transcriptase cùil.
Mar sin, ge bith dè an èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil nas àirde aig AMV, tha a ghnìomhachd RNase H a’ lughdachadh toradh cDNA.Gu dearbh, tha luchd-saothrachaidh ath-bheachdan an-còmhnaidh a’ dèanamh an fheum as fheàrr de na toraidhean aca gus cuir às do ghnìomhachd RNase H ann an transcriptase cùil cho mòr ‘s as urrainn gus toradh cDNA a mheudachadh.
Teòthachd annealing
Structar àrd-sgoile RNA aig teòthachd eadar-dhealaichte
Faic am figear gu h-àrd airson structar àrd-sgoile RNA aig teòthachd eadar-dhealaichte, agus cleachd an inneal air-loidhne mFold gus structar àrd-sgoile a’ chriomag targaid a dhearbhadh fo chumhachan sònraichte teòthachd agus dùmhlachd salainn.Aig 55 ° C, tha structar àrd-sgoile an RNA fhathast gu math toinnte, chan urrainn dha transcriptase cùil obrachadh, agus chan urrainnear an structar àrd-sgoile fhuasgladh gu tur gu 65 ° C, fhad ‘s a tha an teòthachd as fheàrr de AMV agus M-MLV fada nas ìsle na an teòthachd seo.
dè a nì thu?Is e structar na h-àrd-sgoile am paidhir co-phàirteach den teamplaid fhèin, a tha a’ leantainn gu farpais làidir eadar an primer agus an tar-sgrìobhadh cùil agus an teamplaid, a’ leantainn gu sreath de dhuilgheadasan leithid E ìosal agus droch ath-aithris.
dè a nì thu?Na àrdaich ach an teòthachd annealing cho mòr ‘s as urrainn.
Tha mòran de luchd-saothrachaidh ath-bheachdan a’ leasachadh an tar-sgrìobhadh cùil tro innleadaireachd ginteil.Bidh cuid ag àrdachadh teòthachd an ath-bhualadh, leithid Jifan agus Aidelai, agus bidh cuid a’ toirt air falbh a’ bhuidheann gnìomhach de enzyme RNase H gus an dàimh eadar an enzyme agus an teamplaid RNA a leasachadh.Faodaidh dàimh àrd structar na h-àrd-sgoile a chuir a-mach gu farpaiseach agus leughadh troimhe gu rèidh, agus cuideachd leasachadh mòr a thoirt air èifeachdas tar-sgrìobhaidh air ais.
Prìomh phuing: Tha tar-sgrìobhadh air ais nas cudromaiche gus cunbhalachd èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil a leantainn (feumaidh enzyman a bhith chan ann a-mhàin èifeachdach ach cuideachd seasmhach), seach an ìre de shampall a chaidh a luchdachadh, mura h-eil e na PCR cainneachdail gu sònraichte mòr, cha bhith e comasach idir.Ioma cDNA.
Tha diofar luchd-saothrachaidh cuideachd air beagan oidhirpean a dhèanamh ann a bhith a’ sireadh cunbhalachd.Mar eisimpleir, tha a’ mhòr-chuid de chompanaidhean a-nis air tar-sgrìobhadh cùil a phacaigeadh mar phasgan àbhaisteach airson a reic, a tha na dheagh roghainn.
Mar eisimpleir, pasganan Foregene's RT Easy Series:
RT Easy I (Prìomh ro-mheasadh airson a’ chiad iallan pasgan synthesis cDNA)
MIQE (5) - fiosrachadh gine targaid
Tha am figear gu h-àrd a’ mìneachadh
1. Co-dhiù a tha an gine seo èifeachdach airson deuchainnean a-rithist, faodar a dhearbhadh gu coitcheann le deuchainnean a-rithist.
2. Gene ID, tha fios agad.
3. Fad gine, chan eil fad iomlan a 'ghine targaid gu cinnteach na dhuilgheadas.Nuair a bhios tu a’ dealbhadh primers, dèan cinnteach gu bheil fad an amplicon eadar 80-200bp gus dèanamh cinnteach à èifeachdas leudachaidh nas fheàrr.
4. Fiosrachadh coimeas Sequence Blast, feumar coimeas a dhèanamh eadar an gine targaid ann am banca gine gus casg a chuir air leudachadh neo-shònraichte.
5. làthaireachd pseudogenes.Is e sreath DNA a th’ ann am pseudogene coltach ri gine àbhaisteach ach a’ call a ghnìomh àbhaisteach.Bidh e gu tric ann an teaghlach ioma-ghin de eukaryotes.Mar as trice tha e air a riochdachadh le ψ.Is e leth-bhreac DNA genomic neo-ghnìomhach a th’ ann anns an genoma a tha glè choltach ris an t-sreath gine còdaidh., sa chumantas chan eil iad air an tar-sgrìobhadh, agus chan eil brìgh fiosaigeach soilleir aca.
6. Suidheachadh primers an coimeas ri exons agus introns.Anns na bliadhnaichean tràtha, nuair a dh’ fhuasgail sinn duilgheadas truailleadh DNA, bhiodh sinn gu tric a’ toirt aire do shuidheachadh primers, exons, agus introns, agus sa chumantas bheachdaich sinn air dealbhadh primers thairis air introns gus leudachadh DNA a sheachnadh.Feuch an toir thu sùil air an fhigear gu h-ìosal: tha dubh a’ riochdachadh introns, tha grunn blues a’ riochdachadh exons, pinc a’ riochdachadh primers cumanta, agus dearg soilleir a’ riochdachadh primers a tha a ’spangachadh a-staigh.
Sgeamatach, a-riamh fìor
Abair plana foirfe a tha seo a’ coimhead, ach gu dearbh, sa mhòr-chuid de chùisean, chan eil na primers tar-intron cho draoidheil ris a bha dùil, agus bidh iad cuideachd ag adhbhrachadh leudachadh neo-shònraichte.Mar sin is e an dòigh as fheàrr air casg a chuir air truailleadh DNA DNA a thoirt air falbh gu tur.
7. Co-chòrdadh ro-innse.A’ cleachdadh an eisimpleir seo a-rithist, cleachd an inneal mFold air-loidhne gus structar àrd-sgoile a’ chriomag targaid a dhearbhadh aig teòthachd sònraichte agus dùmhlachd salainn.
Structar àrd-sgoile RNA aig teòthachd eadar-dhealaichte
Is e structar na h-àrd-sgoile am paidhir co-phàirteach den teamplaid fhèin, a bheir gu farpais làidir eadar an primer agus am paidhir teamplaid, agus tha an cothrom air ceangal primer nas lugha, a’ leantainn gu sreath de dhuilgheadasan leithid E ìosal agus droch ath-aithris.Tro ro-innse bathar-bog, mura h-eil duilgheadas structair àrd-sgoile ann, bhiodh sin math.Ma tha, bruidhnidh an artaigil leanmhainn againn gu sònraichte mar a dh’ fhuasglas tu an duilgheadas seo.
MIQE (6) - qPCR Oligonucleotides
Airson PCR cainneachdail flùraiseach, is e a’ chiad rud a tha thu a’ strì leis a h-uile latha às-tharraing RNA, agus is dòcha gur e dealbhadh primer an dàrna rud.
An toiseach, bidh sinn fhathast a’ sgrùdadh nan riaghailtean mu dhealbhadh primer a rèir liosta sgrùdaidh MIQE.Tha e cho sìmplidh gum faod na scumbags gàire a dhèanamh, agus is urrainn dhuinn a chrìochnachadh ann an aon seantans: faigh a-mach sreath agus suidheachadh an probe primer agus an dòigh atharrachaidh.Airson an dòigh glanaidh primer, tha synthesis primer cho saor an-dràsta, tha qPCR airidh air DUILLEAG agus nas àirde na dòighean glanaidh, agus chan eil fiosrachadh an ionnstramaid synthesis cudromach.Tha mòran dhaoine air a bhith a’ dèanamh primers airson deicheadan agus chan eil fios aca gur e ABI3900 an synthesizer.
A thaobh prionnsapalan dealbhadh primer, cha leig thu leas an cuimhneachadh le cuimhne, oir faodaidh a’ mhòr-chuid de bhathar-bog dealbhaidh primer no innealan air-loidhne aire a thoirt do na duilgheadasan sin (inneal air-loidhne air a mholadh primer3.ut.ee/), agus chan eil 99.999% de dhealbhadh primer air a dhèanamh le làimh Seall, bidh an t-ùghdar uaireannan a’ dealbhadh ceudan de primers gach latha, ma leughas tu aon às deidh aon, thig e tarsainn.
Dìreach thoir sùil air na puingean a leanas às deidh na primers a dhealbhadh:
1. Dealbhadh primers faisg air deireadh 3 ′: A thaobh a bhith a’ cleachdadh primers oligo dT airson synthesis ciad-shreath cDNA, a’ beachdachadh air èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil agus ionracas RNA, feumar na primers dealbhaichte a dhealbhadh faisg air deireadh 3 ′ gus èifeachdas leudachaidh a leasachadh.Cleachd dealbh airson mìneachadh mar a leanas (chan eil dòigh ann seo a thuigsinn):
Carson a bu chòir primers a dhealbhadh faisg air deireadh 3 ′, chan fhaod e a bhith fìor
2. Luach TM: Tha an luach Tm aig 55-65 ° C (seach gu bheil gnìomhachd exonuclease aig an ìre as àirde aig 60 ° C), agus tha susbaint GC aig 40% -60%.
3. BLAST: Gus leudachadh neo-shònraichte den genoma a sheachnadh, feumar Blast a chleachdadh airson dearbhadh leasachail.
MIQE(7) - pròiseas qPCR
1. qPCR kit
A rèir riatanasan MIQE, feumaidh sinn cunntas soilleir a thoirt air na suidheachaidhean freagairt iomlan san artaigil, a ’toirt a-steach rèiteachadh an t-siostam ath-bhualadh PCR, dè an uidheamachd a thathas a’ cleachdadh, cò an neach-dèanamh, dè cho mòr ‘s a tha an siostam ath-bhualadh, ge bith a bheil an dòigh dath no an dòigh sgrùdaidh air a chleachdadh, roghainnean prògram PCR.Bidh seann dhraibhearan gu cinnteach a’ faighinn a-mach, fhad ‘s a thèid an uidheamachd a thaghadh, gu bheil am fiosrachadh gu h-àrd air a dhearbhadh gu bunaiteach.
Aig an àm seo, tha dèanamh agus cinneasachadh innealan PCR cainneachdail fluorescent na theicneòlas gu math aibidh.Cho fad ‘s nach tagh thu luchd-saothrachaidh fìor dhona, chan eil an coltachd de dhuilgheadasan àrd, ach tha sinn fhathast airson beagan phuingean a roinn riut:
Enzym Taq tòiseachaidh teth:Is e am pàirt as cudromaiche de PCR an enzyme Taq tòiseachaidh teth.Tha na h-enzyman tòiseachaidh teth air a’ mhargaidh mar as trice air an roinn ann an dà sheòrsa, tha aon na enzym tòiseachaidh teth a chaidh atharrachadh gu ceimigeach (faodaidh tu smaoineachadh air mar in-ghabhail paraffin), agus am fear eile a tha na enzyme tòiseachaidh teth airson atharrachadh antibody (ceangail antigen-antibody).Tha atharrachadh ceimigeach na dhòigh thràth air enzyman tòiseachaidh teth.Nuair a ruigear teòthachd sònraichte, leigidh an enzyme a ghnìomhachd a-mach.Bidh an enzyme tòiseachaidh teth atharraichte le antibody a’ cleachdadh dhòighean bith-eòlasach gus gnìomhachd an enzyme a bhacadh.Nuair a ruigear teòthachd sònraichte, thèid an antibody a dhì-nàdarachadh agus a chuir an gnìomh mar phròtain, agus thèid gnìomhachd an enzyme a thoirt a-steach.
Ach, dè an cleachdadh a tha seo?Tha seo fìor, tha gnìomhachd fuasglaidh enzyman a chaidh atharrachadh le antibody nas luaithe na gnìomhachd enzyman a chaidh atharrachadh gu ceimigeach, agus mar sin a thaobh cugallachd, tha buannachd bheag aig enzyman atharraichte le antibody, gus nach bi enzyman air an atharrachadh gu ceimigeach anns na piseagan air a’ mhargaidh.Ma tha, tha teicneòlas an neach-dèanamh seo fhathast an sàs ann an àm na mìle bliadhna.
Co-chruinneachadh ion magnesium:Tha dùmhlachd ion magnesium glè chudromach ann am freagairt PCR.Faodaidh dùmhlachd ion magnesium iomchaidh sgaoileadh gnìomhachd enzyme Taq a bhrosnachadh.Ma tha an dùmhlachd ro ìosal, thèid gnìomhachd an enzyme a lughdachadh gu mòr;ma tha an dùmhlachd ro àrd, thèid an leudachadh neo-shònraichte le enzyme-catalyzed a leasachadh.Bheir dùmhlachd ions magnesium buaidh cuideachd air annealing primers, teòthachd leaghaidh an teamplaid agus toraidhean PCR, agus mar sin a’ toirt buaidh air toradh mìrean leudaichte.Mar as trice tha smachd air dùmhlachd ions magnesium aig 25mM.Gu dearbh, airson deagh ghoireas, feumar smachd math a chumail air dùmhlachd ions magnesium.Bidh cuid de mharsantan a’ cur àidseant chelating ian magnesium ris an reagent, a dh’ fhaodas buaidh atharrachadh fèin-ghluasadach air dùmhlachd ion magnesium.
Co-chruinneachadh dath flùraiseach:Bidh dath flùraiseach, a tha mar an SYBR Green a bhios sinn a’ cleachdadh mar as trice, a’ gineadh flùraiseachd sa mhòr-chuid le bhith a’ ceangal ris a’ chliabh bheag de DNA le sreathan dùbailte, leis gu bheil ceangal an dath ri DNA dà-shreath neo-shònraichte, is e sin ri ràdh Cho fad ‘s a thèid DNA dà-shreath a chur còmhla ris, faodaidh fluorescence tachairt, agus mar sin bidh primer-dimers agus teamplaidean DNA a’ tighinn còmhla gus comharradh a dhèanamh le teamplaidean DNA san t-siostam.
PS: Mar thoradh air na feartan a tha mothachail air solas, bidh toraidhean air a’ mhargaidh mar as trice air am pacadh ann an tiùban centrifuge donn neo-shoilleir (mar a chithear san dealbh gu h-ìosal).Ach, thig seo tarsainn air duilgheadas.Tha e duilich faicinn a bheil an leaghan air a dheoghal nuair a thathar a’ samplachadh.A thaobh seo, is e Qingke gu dearbh an fheadhainn as fhasa a chleachdadh (mar a chithear san dealbh gu h-ìosal), agus tha an tiùb follaiseach air a phacadh ann am baga staoin neo-shoilleir.An uairsin cuir a-steach e ann am baga staoin, a ’toirt aire do ghoireasachd solas a sheachnadh agus samplachadh.Feumaidh tu an àireamh toraidh ceart a thaghadh.Tha TSE204 na bheatha air leth cosg-èifeachdach, a tha gam fhàgail ag iarraidh feur a chur.
Tha dùmhlachd an dath fluorescent cuideachd glè chudromach.Ma tha an dùmhlachd ro ìosal, cha tèid an lùb leudachaidh suas nas fhaide air adhart agus chan eil e foirfe;ma tha an dùmhlachd ro àrd, cuiridh e bacadh fuaim air.Leis gu bheil am PCR cainneachdail fluorescent gu mòr an urra ri luach CT, mura h-eil dùmhlachd an dath flùraiseach air atharrachadh gu ceart, tha am puing ìosal nas fheàrr na a’ phuing àrd.Gu dearbh, is e an dùmhlachd dath iomchaidh as fheàrr.
ROX: Bithear a’ cleachdadh dathan ROX gus mearachdan comharran flùraiseach a cheartachadh gu math.Feumaidh cuid de luchd-saothrachaidh ionnstramaidean calibration, ach chan eil cuid eile.Mar eisimpleir, mar as trice bidh feum air calibration airson cleachdadh inneal leudachaidh PCR Real Time Thermo Fisher Scientific, a’ gabhail a-steach 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, msaa.
Tha dath ROX aig Foregene's qPCR Mix cuideachd, a tha goireasach airson a chleachdadh ann an grunn mhodalan.
Làimhseachadh bann hydrogen lag: Tha làimhseachadh bannan lag hydrogen na chùis gu math teignigeach.Chan eil dad air leabhraichean-làimhe mòran de chitichean a leughadh, ach cha tug gin dhiubh iomradh air a’ chuspair seo.Gu dearbh, tha e cho cudromach.Tha an cothlamadh de bhunaitean gu mòr an urra ri neart bannan hydrogen.Tha bannan hydrogen làidir mar leudachadh àbhaisteach, agus tha bannan lag hydrogen a’ leantainn gu leudachadh neo-shònraichte.Mura h-urrainnear cuir às gu math ri bannan lag hydrogen, cha ghabh leudachadh neo-shònraichte a sheachnadh.Taobh a-staigh raon an ùghdair, chan eil ach beagan chompanaidhean air an duilgheadas seo fhaicinn.Nuair a cheannaicheas tu an cromag, faodaidh tu iomradh a thoirt air an do bheachdaich thu air fuasgladh a thaobh seo airson a’ chidsin a tha thu airson a thaghadh.
Meud freagairt: Tha an siostam 20-50ul air a chleachdadh nas cumanta, agus tha e coltach gum bi tomhasan nas lugha ag adhbhrachadh mhearachdan.San fharsaingeachd, molaidh an stiùireadh kit cleachdadh meudan freagairt PCR.Na bi glic agus cleachd leabhraichean nas lugha gus cosgaisean a shàbhaladh.an t-amas aig.Chaidh deuchainn a dhèanamh air an tomhas-lìonaidh a mhol na ceannaichean, agus is dòcha nach urrainn dhaibh fuasgladh fhaighinn air duilgheadas mhearachdan air adhbhrachadh le meudan beaga.
2. An neach-dèanamh agus àireamh artaigil a 'phlàta tiùba
Tha fios aig a h-uile duine air prionnsapal PCR cainneachdail fluorescent.Tha cruinneachadh fluorescence gu ìre mhòr air a dhèanamh tro chaiptean tiùb PCR.Nuair a thaghas tu PCR consumables, thoir aire do dhà phuing: deagh sgaoileadh solais agus freagarrach airson an ionnstramaid.San fharsaingeachd, tha na bùird agus na tiùban de bhrandan prìomh-shruthach gu math, ach feumaidh tu taghadh gu faiceallach a thaobh atharrachadh, air neo cha bhith e comasach dhut an ionnstramaid a chleachdadh.
4. Eòlas ìre àrd
MIQE (8) - dearbhadh qPCR
Is e seo am prìomh phrìomhachas aig qPCR!Tha uimhir de ghaisgich air tuiteam dhan ghainmhich an seo.Gu dearbh, tha e comasach cuideachd gu bheil thu fortanach agus gu bheil na ginean a rinn thu sgrùdadh sìmplidh, agus mar sin chaidh thu tron uaimh deighe ri taobh na gaoithe.Tha am fiosrachadh dearbhaidh aig qPCR an dùil dearbhadh a dhèanamh air earbsachd an dàta.Bidh sinn a’ liostadh an fhiosrachaidh dearbhaidh riatanach mar a leanas:
1.Specificity deuchainn
Bithear a’ dèanamh deuchainn air sònrachas meudachaidh gine targaid le bhith a’ sgrùdadh a bheil an dealbh electrophoresis mar aon chòmhlan;dearbhadh òrdugh;lùb leaghaidh gus faicinn a bheil am mapa stùc singilte;dearbhadh cnàmhadh enzyme agus dòighean eile.
An seo, bidh sinn a’ cuimseachadh air tmion-sgrùdadh air leudachadh neo-shònraichte a’ cleachdadh an dòigh air lùban a leaghadh.Anns an fharsaingeachd, nuair a bhios sinn a 'dealbhadh primers, feumaidh meud a' chriomag toraidh a bhith anns an raon de 80-200bp, a tha a 'dèanamh teòthachd leaghaidh an toraidh PCR raon 80-85 ° C.Mar sin, ma tha stùcan measgaichte ann, feumaidh toraidhean leudachaidh neo-shònraichte eile a bhith ann;ma tha an stùc a’ nochdadh fo 80 ° C, mar as trice thathas den bheachd gur e primer dimer a th’ ann;ma tha an stùc a’ nochdadh os cionn 85 ° C, sa chumantas thathas den bheachd gur e truailleadh DNA a th’ ann no leudachadh neo-shònraichte air mìrean mòra.
Nota: Uaireannan chan eil ann ach aon stùc aig 80 ° C.Aig an àm seo, feumar cumail ris a 'bhun-bheachd seo.Tha e coltach gu bheil na toraidhean leudachaidh uile primer dimers.
An lùb leaghaidh àbhaisteach (aon stùc gun leudachadh neo-shònraichte)
Lùb leaghaidh trioblaideach (leudachadh neo-shònraichte de stùcan spùtach)
【Mion-sgrùdadh cùise】
Tha prìomh stùc ann, ach tha an primer dimer dona
Faodaidh an lùb leaghaidh aon-mhullaich anns an fhigear gu h-ìosal do shùilean a mhealladh gu furasta, a ’smaoineachadh gur e deuchainn foirfe a th’ ann, ach tha an toradh gu tur ceàrr.Aig an àm seo, feumaidh sinn coimhead air an teòthachd leaghaidh.Tha an teòthachd as àirde fo 80 ° C, a tha gu tur primer-dimer.
Gun chriomag targaid, a h-uile primer dimers
An seo, chan urrainn dha mo bhràthair stad.Anns an dealbh gu h-ìosal tha dealbh a chaidh a thogail le fòn-làimhe air a chuir thugam le scumbag.Tha na h-ath-bheachdan a chleachd e uile nan suaicheantasan cumanta sa ghnìomhachas.Dh’ atharraich e bho aon bhrannd T-prefix gu brannd T-prefix eile.Tha mi a’ smaoineachadh gu bheil thu air tomhas a dhèanamh mu thràth.Ghlaodh an scumbag rium: “Tha an ath-ghnìomhaiche a chaidh a chleachdadh sa chiad dealbh ro mhath, agus tha an stùc singilte.Nas fhaide air adhart, an dèidh a bhith a 'cleachdadh an reagent a mhol thu, bidh e coltach ris an dàrna dealbh, le mullaichean measgaichte.Tha thu air mo dhèanamh truagh.“
Roinn an dà ghraf.Aig a 'chiad sealladh, tha aon stùc aig aon dhiubh, agus tha stùc dhùbailte aig an fhear eile.Nonsense, gu dearbh tha aon stùc ceart gu leòr.A bheil sin fìor?
Nas miosa na Dou E, ma chuireas mi an dà dhealbh anns an dealbh gu h-ìosal, tuigidh tu sa bhad.Gu dearbh, tha sinn furasta am pairilis leis an t-seòrsa dealbh seo.Às deidh mion-sgrùdadh faiceallach, lorg sinn: tha an ìre as àirde den chiad fhigear aig 75 ° C, a tha gu tur primer dimer;tha stùc an dàrna figear a’ nochdadh aig 75 ° C agus 82 ° C, co-dhiù tha an toradh a’ nochdadh.
Dealbhan le beachdan bho oileanaich a
Mar sin chan e an duilgheadas bunaiteach duilgheadas ath-bheachdan, ach duilgheadas dealbhadh primer.Aig an aon àm, tha e cuideachd a 'dearbhadh nach eil cuid de bhrandagan mòra de chàileachd iarainn, agus tha e cuideachd a' dearbhadh na thuirt mo bhràthair roimhe: Chan e am brannd reagent a tha a 'toirt taic don artaigil agad.Is e an artaigil agad a bhrosnaich suaicheantas ath-bheachdan.Dìreach smaoinich, mura atharraich an scumbag na h-ath-bheachdan, bhiodh an dàta ceàrr air a chuir chun iris, agus bhiodh na thachradh na bhròn-chluich.
2. Ct luach smachd bàn
Na mìnich, ma tha luach Ct aig an smachd bàn, nach e truailleadh a th’ ann?Ach, feumaidh tu fhathast tuigsinn dè an smachd bàn aig a bheil luach Ct.Mas e NTC a th’ ann, tha e a’ ciallachadh gu bheil DNA cèin ann leithid truailleadh reagent.Mas e NRT a th’ ann, tha e a’ ciallachadh gu bheil truailleadh DNA aig an RNA a chaidh a thoirt a-mach.
3. Curve àbhaisteach
A’ gabhail a-steach an leathad agus an fhoirmle àireamhachaidh, faodar èifeachdas PCR a thomhas tron fhoirmle.Tha deuchainn foirfe ag iarraidh gum bi leathad an lùb àbhaisteach faisg air 3.32, agus R² a’ tighinn faisg air 0.9999.
4. Raon fiùghantach loidhneach
Tha raon fiùghantach an ath-bhualadh sreathach.A rèir an teamplaid a chaidh a chleachdadh gus an lùb àbhaisteach a ghineadh, bu chòir don raon fiùghantach a bhith a’ toirt a-steach co-dhiù 5 caisead dùmhlachd, agus aire a thoirt do atharrachadh luachan Ct aig caiseadan dùmhlachd àrd agus caiseadan dùmhlachd ìosal.
5. Cruinneas lorgaidh
Tha atharrachaidhean ann an toraidhean qPCR, is e sin, droch ath-aithris, is e sin, droch chruinneas, air adhbhrachadh le mòran fhactaran, a’ toirt a-steach teòthachd, dùmhlachd, agus obrachadh.Mar as trice bidh cruinneas qPCR a’ fàs nas lugha smachd mar a bhios àireamh leth-bhreac a’ dol sìos.Mas fheàrr eadar-dhealachadh taobh a-staigh deuchainneach, bu chòir don atharrachadh teignigeach seo a bhith eadar-dhealaichte bho atharrachadh bith-eòlasach, agus faodaidh mac-samhail bith-eòlasach dèiligeadh gu dìreach ri eadar-dhealachaidhean staitistigeil ann an toraidhean qPCR eadar buidhnean no leigheasan.Gu sònraichte airson measaidhean breithneachaidh, feumar cunntas a thoirt air a’ chruinneas eadar-mheasadh as fheàrr (ath-aithris) thar làraich agus gnìomhaichean.
6. Èifeachdas lorgaidh agus LOD (ann an ioma-fhillte qPCR)
Is e LOD an ìre as ìsle de 95% de shamhlaichean dearbhach a chaidh a lorg.Ann am faclan eile, cha bu chòir an dùmhlachd de LOD a tha taobh a-staigh seata de ghinean targaid a bhith nas àirde na 5% de na h-ath-bheachdan a dh’ fhàillig.Nuair a bhios tu a’ dèanamh mion-sgrùdadh qPCR ioma-fhillte, gu sònraichte airson a bhith a’ lorg mùthaidhean puing no polymorphisms aig an aon àm, feumaidh ioma-fhillte qPCR fianais a thoirt seachad nach eil cruinneas ioma-mhìrean targaid air a chuir an cunnart san aon phìob, lorg ioma-lorg agus lorg tiùb singilte Bu chòir èifeachd agus LOD a bhith mar an ceudna.Gu sònraichte nuair a thèid ginean targaid àrd-dùmhlachd agus ginean targaid dùmhlachd ìosal àrdachadh aig an aon àm, feumar aire a thoirt don duilgheadas seo.
Duilgheadasan agus fuasglaidheanSan fharsaingeachd, bidh na duilgheadasan a thig gu tric ann an debugging qPCR a’ cuimseachadh air na taobhan a leanas:
· leudachadh neo-shònraichte
· Roghainn duilich de chuimseachadh primer agus trioblaid le primer-dimers
· Tha an teòthachd annealing mearachdach
· Tha structar àrd-sgoile a’ toirt buaidh air èifeachdas leudachaidh
leudachadh neo-shònraichte
leudachadh neo-shònraichtea 'tachairt, mar as trice thathar a' beachdachadh nach eil an dealbhadh primer freagarrach, ach mura h-eil thu ann an cabhag gus na primers atharrachadh, faodaidh tu na dòighean a leanas fheuchainn an-toiseach (tha am prionnsabal ceangailte cuideachd):
· Àrdaich an teòthachd annealing - feuch nach urrainn dha bannan lag hydrogen a chumail suas;
· Giorraich ùine annealing agus leudachadh - lughdaich an cothrom air bannan hydrogen lag;
· Lùghdaich dùmhlachd primer - lughdaich an cothrom a bhith a’ ceangal primers gun fheum agus roinnean nach eil ag amas;
Èifeachdas leudachaidh ìosal
Tha an suidheachadh mu choinneamh leudachadh neo-shònraichte - èifeachdas leudachaidh ìosal , agus na ceumannan gus dèiligeadh ri èifeachdas leudachaidh ìosal dìreach mu choinneamh:
· Leudaich an ùine annealing agus leudachadh;
· Atharraich gu PCR trì-cheum agus lughdaich an teòthachd annealing;
· Meudaich an dùmhlachd primer;
Ps: Tha mòran oileanach ceumnachaidh a rugadh anns na 90n deònach sgrùdadh a dhèanamh air mar a nì thu deuchainnean dì-bhugachaidh, agus an dòchas gun urrainn don phasgan an duilgheadas fhuasgladh gu tur (ma tha thu airson a dhol gu companaidh reagent gus rannsachadh agus leasachadh a dhèanamh às deidh ceumnachadh), gu dearbh, tha an luchd-saothrachaidh ath-bheachdan cuideachd a’ smaoineachadh air an dòigh seo, tha mi an dòchas gur e amadan a th’ ann Faodar a chleachdadh nuair a gheibh thu e, agus mar sin tha luchd-saothrachaidh ath-bheachdan air mòran oidhirp a chuir seachad gus fuasgladh fhaighinn air an duilgheadas - a dh’ aindeoin cuid de dh ’oidhirpean lag gus fuasgladh fhaighinn air an duilgheadas. factaran orption.Gus an duilgheadas fhuasgladh gu furasta, feumaidh amadan fhathast ro-ràdh a’ chompanaidh ath-bheachdan a leughadh gus faicinn a bheil feart ann a tha a’ gabhail a-steach bannan lag hydrogen.
Roghainn duilich de chuimseachadh primer agus trioblaid le primer-dimers
Dòigh 1: San fharsaingeachd, tha an stiùireadh pasgan airson qPCR air siostaman a mholadh agus dùmhlachdan primer a mholadh.
Dòigh 2: Debugging le bhith a 'suidheachadh an caisead dùmhlachd primer.Tha an dealbh gu h-ìosal air a ghoid bho chompanaidh gus a dhealbhachadh.Tha am figear gu h-ìosal a’ sealltainn na toraidhean cainneachdail fluorescence a chaidh a dhèanamh le trì caiseadan dùmhlachd primer (100nM, 250nM, 500nM) agus ceithir caiseadan dùmhlachd teamplaid (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Tha luach Ct nan toraidhean deuchainneach air a dhealbhadh mar a leanas:
Taghadh Tùsachaidh Primer Co-cheangail gach dùmhlachd primer gu loidhne mar a leanas:
Tha an roghainn dùmhlachd primer follaiseach, tha an dàimh sreathach eadar dùmhlachd primer de 100nM agus 250nM nas fheàrr, agus tha an dàimh sreathach aig dùmhlachd primer de 500nM gu ìre mhath bochd.Ann an 100nM agus 250nM, tha luach Ct de 250nM gu ìre mhath beag, agus mar sin is e an dùmhlachd primer as fheàrr 250nM.Mar as trice chithear primer-dimers cruaidh anns an lùb leaghaidh.Dè mura h-urrainn dha na primers dealbhaichte primer-dimers a sheachnadh?
Dòigh 3: Lùghdaich an àireamh de primers agus àrdaich an teòthachd annealing (chan eil feum air mìneachadh).
Is e luach empirigeach an teòthachd annealing 60 ° C.Mura h-eil thu cinnteach, ciamar a roghnaicheas tu teòthachd analachaidh nas freagarraiche?Tha am freagairt an aon rud ris an roghainn de chuimseachadh primer -deuchainn caisead.Gabh dealbh bhon chompanaidh Bio-rad gus an duilgheadas a nochdadh.Airson leudachadh air criomag targaid sònraichte, suidhich ochd caiseadan teodhachd, gach fear le trì ath-aithris, agus tha an lùb leudachaidh a gheibhear mar a leanas:
taghadh teòthachd annealing:
· 70 ° C, 69 ° C - Gu bunaiteach, chan urrainnear na primers a chur còmhla, agus mar sin chan eil leudachadh ann.
· 67.3 ° C - Tha beagan leudachaidh aig an toiseach, agus tha an luach Ct an ìre mhath mòr.
· 64.5 ° C —— Tha luach Ct a’ dol sìos.
· Aig 60.7 ° C, 58.0 ° C, 56.2 ° C, agus 55.0 ° C, bha na luachan Ct gu bunaiteach buailteach a bhith seasmhach, ach bha na luachan flùraiseach deireannach eadar-dhealaichte.
Ciamar a thaghadh?Prionnsabal: Is e a’ chiad phrionnsapal an luach Ct nas àirde.Airson an aon luach Ct, tagh teòthachd annealing nas àirde gus lughdachadh agus leudachadh neo-shònraichte a sheachnadh.Ged a tha luach fluorescence nas àirde aig 55 ° C, dh’ fhaodadh gum bi dimers no leudachadh neo-shònraichte ann.
Ach ma tha thu cho sgiobalta riut fhèin, smaoinichidh tu gu cinnteach: Gu loidsigeach, ma tha an ath-bhualadh PCR gu math sònraichte, fhad ‘s a tha an dùmhlachd primer nas àirde na an riatanas as ìsle, cha bu chòir buaidh sam bith a bhith aig na puingean àrda is ìosal, dìreach mar dathan flùraiseach agus dNTP.Gu dearbh, fhad ‘s a tha an teòthachd annealing air a mheudachadh gu ceart, thèid buaidh dùmhlachd primer air luach Ct a lughdachadh gu nàdarra.
Tha an teòthachd annealing air a bharrrachadh gu ceart, agus thèid buaidh dùmhlachd primer air CT a lughdachadh
Tha structar àrd-sgoile a’ toirt buaidh air èifeachdas leudachaidh
Gabhamaid an dealbh bho Bio-rad gus an duilgheadas a nochdadh.Bidh e cuideachd a’ dealbhadh caisead teodhachd gus gine àrdachadh le structar àrd-sgoile.
Tha structar àrd-sgoile a’ nochdadh
Chìthear mar a bhios an caisead teodhachd a’ dol sìos, gu bheil toraidhean a’ tòiseachadh a’ nochdadh agus luach Ct a’ gluasad air adhart, a’ ruighinn an luach as ìsle aig 60.7 ° C, agus an uairsin mar a bhios an caisead teodhachd a’ dol sìos, bidh an luach Ct a’ fàs nas motha.Air an làimh eile, mar a bhios an teòthachd ag àrdachadh, bidh an structar àrd-sgoile a ’fosgladh agus tha èifeachdas leudachaidh ag àrdachadh.Às deidh teòthachd sònraichte a ruighinn, chan urrainn àrdachadh teòthachd àrdachadh èifeachdas leudachaidh.Leis nach urrainn na primers a chur còmhla gu seasmhach aig an àm seo.Mar sin,coimhead airson an teòthachd leis an luach Ct as ìsle, dè an teòthachd as fheàrr airson an teamplaid structar àrd-sgoile a mheudachadh!Gu dearbh, feumaidh fios a bhith aig amadan snasail mura h-eil e riatanach, gu bheil e nas fheàrr na primers atharrachadh agus an roinn structar àrd-sgoile a sheachnadh.
5. Ìre tagraidh
MIQE - Mion-sgrùdadh Dàta
Tha am mion-sgrùdadh dàta air a thoirt seachad sa mhòr-chuid leis an ionnstramaid PCR cainneachdail fluorescent.Anns an artaigil roimhe, chaidh tòrr obair mion-sgrùdadh dàta a dhèanamh, leithid an smachd bàn, a chaidh a mhìneachadh ann an dealbhadh an deuchainn.Chaidh na ginean iomraidh a-staigh, àireamhan ath-aithris, msaa a shoilleireachadh., an seo tha sinn gu ìre mhòr a’ mìneachadh cleachdadh qPCR.
Tha qPCR air a chleachdadh gu farsaing, agus is e dearbhadh deuchainneach agus breithneachadh searbhag niuclasach na suidheachaidhean as cumanta.
àireamhachadh iomlan
Tha dàimh sreathach aig log (cruinneachadh tùsail) leis an àireamh de chuairtean.Faodar lùb àbhaisteach a tharraing bho inbhe le àireamh copaidh tùsail aithnichte, is e sin, gheibhear an dàimh sreathach den fhreagairt leudachaidh.A rèir luach Ct an t-sampall, faodar an dùmhlachd san sampall obrachadh a-mach.An àireamh de theamplaidean ri ghabhail a-steach.
Modh àireamhachaidh iomlan
Feumaidh àireamhachadh iomlan a bhith stèidhichte air an lùb àbhaisteach.Gus lùb àbhaisteach a dhèanamh, tha feum air ìre àbhaisteach.Mar as trice, is e plasmid an inbhe a gheibhear le bhith a’ clonadh a’ ghine targaid.Carson a tha e plasmid?Leis gur e DNA plasmid cruinn an fheadhainn as seasmhaiche.Lùghdaich an toradh àbhaisteach ann an caisead 5 gu 6 a rèir a’ cho-mheas dùblachaidh (caolachadh 10-fhillte), agus thoir aire don èideadh nuair a bhios tu a’ lagachadh.Leig leis an luach Ct tuiteam eadar 15-30.
Ullachadh àbhaisteach
Aig an aon àm, bu chòir an sampall a thèid a dhearbhadh a bhith air a lagachadh a rèir sin (cuimhnich am bàillidh caolachaidh), agus bu chòir luach Ct tuiteam cuideachd eadar 15-30.Tha an toradh àbhaisteach + an sampall a thèid a dhearbhadh air a chuir air an inneal còmhla.Às deidh an ruith, chaidh lùb àbhaisteach a dhèanamh leis an stuth àbhaisteach, agus chaidh na sampallan a bha rin deuchainn a thoirt a-steach don lùb àbhaisteach gus an dùmhlachd obrachadh a-mach.
Tha àireamhachadh bhìoras Hepatitis B HBV na thomhas àbhaisteach iomlan, as urrainn àireamh leth-bhreac bhìoras obrachadh a-mach ann an 1ml de fhuil.
A 'cunntadh àireamh leth-bhreac
Sampall dùmhlachd ri dhearbhadh (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × factar caolachaidh
Eisimpleir cuideam moileciuil = àireamh bhunaitean × 324
An àireamh leth-bhreac den sampall a thèid a dhearbhadh (lethbhric / ul) = dùmhlachd an t-sampall ri dhearbhadh / cuideam moileciuil an t-sampall × 6 × 1014
Dòigh àireamhachaidh airson lethbhreac àireamh
Is e na tha gu h-àrd an dòigh àireamhachaidh airson a bhith a’ dearbhadh meud.Is e duilgheadas matamataigeach a tha seo a dh’ fhaodar fhuasgladh às deidh ceumnachadh bhon àrd-sgoil òg, agus mar as trice bidh duilgheadasan matamataigeach air am fuasgladh le coimpiutairean.Mura h-eil thu a 'tuigsinn, faodaidh tu tighinn airson conaltradh.
tomhas coimeasach
Tha àireamhachadh coimeasach air a chleachdadh sa mhòr-chuid ann an rannsachadh saidheansail.Cia mheud bhìoras a tha ann an 1ml de fhuil, agus is e bhìoras DNA a th 'ann, is e tachartas an ìre mhath cinnteach a tha seo: faodar an ìre fala a dhearbhadh, agus tha am bhìoras DNA gu ìre mhath seasmhach.Ach, tha e duilich dhuinn coimeas a dhèanamh eadar an àireamh de lethbhric tar-sgrìobhaidh de ghine sònraichte ann an duilleag, leis gu bheil e duilich meud, cuideam agus tairgse na duilleige a dhearbhadh, tha an ìre de RNA a chaidh a thoirt a-mach duilich a dhearbhadh, agus tha èifeachdas tar-sgrìobhadh cùil cuideachd duilich a dhearbhadh , is e sin ri ràdh, faodaidh ceum sam bith toirt air bugaichean an dàta deuchainneach agus chan urrainnear a chleachdadh.
Mar sin, feumaidh tomhas coimeasach eileamaid a thoirt a-steach:an gine iomraidh a-staigh.
Ann am faclan eile, tha tomhas coimeasach gu dearbh na choimeas eadar an gine targaid agus an gine iomraidh a-staigh.An coimeas ris an aon inneal agus an aon chealla, tha buaidh meud sampall, meud às-tharraing RNA, èifeachdas tar-sgrìobhaidh air ais, agus èifeachdas PCR gu ìre mhath beag.Mar thoradh air meud beag an t-sampall, chaidh an dà chuid ginean iomraidh a-staigh agus ginean targaid a lughdachadh gu ìre mhath.Sin as coireach gu bheil sinn air a bhith a’ cur cuideam air èideadh agus seasmhachd roimhe seo.
Tha ginean iomraidh taobh a-staigh san fharsaingeachdginean gleidhidh taighe(ginean cumail taighe), a tha a’ toirt iomradh air clas de ghinean a tha air an cur an cèill gu seasmhach anns a h-uile cealla, agus tha na toraidhean aca riatanach gus gnìomhachd beatha bunaiteach cheallan a chumail suas.
Na cuir a-mach am bun-bheachd seo.Tha ginean gleidhidh taighe nan teirmean gnìomh bith-eòlasach, agus tha ginean iomraidh taobh a-staigh nan teirmean teignigeach deuchainneach.Feumaidh ginean cumail-taighe dearbhadh a thoirt seachad mus gabh an taghadh mar ghinean iomraidh a-staigh.
Mar eisimpleir, thagh sinn grunn ghinean cumail-taighe san fhigear gu h-ìosal gus na h-ìrean faireachdainn aca ann an diofar cheallan clò a dhearbhadh, agus lorg sinn gu robh na h-ìrean faireachdainn de β-2-microglobulin gu math eadar-dhealaichte bho ìrean nan trì ginean eile, agus mar sin cha b’ urrainnear an cleachdadh mar ghinean iomraidh a-staigh.
Às deidh tuigse fhaighinn air gnìomh ceartachaidh a ’ghine iomraidh a-staigh, thig dà algorithm mar thoradh air toirt a-steach gine iomraidh a-staigh.
· modh lùb àbhaisteach dùbailte
·2 - △△ Modh Ct (modh coimeas luach CT)
Ma tha ùidh agad ann a bhith a’ sgrùdadh gnèithean agus gnìomhan gine, feuch an toir thu seachad an rannsachadh air algorithms agus cleachd foirmlean gu dìreach, no cleachd innealan gu dìreach;ma tha thu nad ghille dìreach ann am matamataig agus innleadaireachd, na bi leisg.
modh lùb àbhaisteach dùbailte
Dèan tomhas air gine targaid agus gine gleidhidh taighe an t-sampall smachd agus an sampall a thèid a dhearbhadh tron lùb àbhaisteach, agus an uairsin obrachadh a-mach an luach coimeasach a rèir na foirmle àireamhachaidh, is e sin an ìre faireachdainn càirdeach.
Buannachdan: mion-sgrùdadh sìmplidh, optimization deuchainneach an ìre mhath sìmplidh
Eas-bhuannachd: Airson gach gine, feumaidh gach cuairt de dheuchainnean lùb àbhaisteach a dhèanamh
Iarrtas: Aon den dà dhòigh cainneachdail as cumanta agus as aithnichte ann a bhith a’ sgrùdadh riaghladh faireachdainn gine
Tha am foirmle mar a leanas:
Tha eisimpleirean mar a leanas:
Obraich a-mach an t-suim coimeasach stèidhichte air an toradh àireamhach
2 - △△ Modh Ct (modh coimeas luach CT)
Buannachdan: Chan eil feum air lùb àbhaisteach a dhèanamh
Eas-bhuannachdan: Thathas den bheachd gu bheil an èifeachdas leudachaidh faisg air 100%;tha an claonadh àbhaisteach <5%, agus thathas a’ gabhail ris gu bheil an lùb àbhaisteach agus an èifeachdas eadar gach leudachadh cunbhalach;tha optimization suidheachaidhean deuchainneach nas iom-fhillte.
Iarrtas: Aon den dà dhòigh cainneachdail as cumanta agus as aithnichte ann a bhith a’ sgrùdadh riaghladh faireachdainn gine
Gu dearbh, mar as trice tha e do-dhèanta an èifeachdas leudachaidh a bhith foirfe 1. Modh ceartachaidh: Ma tha fios againn gu bheil an aon èifeachdas leudachaidh aig a’ ghine targaid agus an gine iomraidh, ach nach eil an èifeachdas leudachaidh co-ionann ri 1, an uairsin faodar 2 －△△Ct a cheartachadh mar: (1+E)－△△Ct, mar eisimpleir △△Ct, mar eisimpleir, 95 ma thèid an àireamhachadh a cheartachadh. 5－△△Ct
Gu ruige seo, tha an susbaint mu PCR cainneachdail fluorescent air tighinn gu crìch.
Ùine puist: Giblean-06-2023
