Tha deuchainn RT-qPCR a’ toirt a-steach às-tharraing RNA agus measadh càileachd, ath-sgrìobhadh air ais agus qPCR trì ceumannan, tha tòrr rabhadh aig gach ceum, bheir sinn a-steach gu mionaideach gu h-ìosal.

Ⅰ.Measadh càileachd RNA

Ann an deuchainn RT-qPCR, às deidh crìoch a chuir air às-tharraing RNA, feumar càileachd RNA a mheasadh, agus chan urrainnear an deuchainn leanmhainn a dhèanamh ach às deidh dha teisteanas fhaighinn.Tha dòighean measaidh a’ toirt a-steach spectrophotometer, electrophoresis gel Agilent, mion-sgrùdadh Agilent 2100, am measg an lorgadh modh electrophoresis speactrophotometer as cumanta agus gel agarose.Bu chòir a thoirt fa-near gum feumar an dà dhòigh seo a chleachdadh còmhla gus lorg agus sgrùdadh a dhèanamh air dùmhlachd RNA, purrachd agus ionracas, gus dèanamh cinnteach à càileachd RNA.

Kit Iomallach RNA co-cheangailte: 

Cell Iomlan RNA Kit Iomallach

Faodar RNA iomlan fìor-ghlan agus àrd-inbhe fhaighinn bho dhiofar cheallan cultarach ann an 11min.

Kit Iomallach RNA Iomlan bheathaichean

Thoir a-mach gu sgiobalta agus gu h-èifeachdach RNA iomlan fìor-ghlan agus àrd-inbhe bho dhiofar stuthan beathach.

Spectrophotometer:

Tha an speactrophotometer air a chleachdadh sa mhòr-chuid gus dùmhlachd agus purrachd RNA a dhearbhadh, ach chan urrainn dha ionracas RNA agus fuigheall genomic a lorg.Nam measg, tha A260/280 agus A260/230 nam paramadairean cudromach airson lorg purrachd RNA, agus faodar purrachd RNA a lorg a rèir atharrachadh nan luachan aca:

1. 1.9< A260/280< 2.1, a' sealltainn gu bheil purrachd RNA math;A260/280<1.9, a’ nochdadh gum faodadh fuigheall pròtain a bhith ann an RNA;A260/280> 2.1, a’ nochdadh truailleadh pàirt de RNA a dh’ fhaodadh a bhith air a dhearbhadh tuilleadh le electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, a' sealltainn gu bheil purrachd RNA math;A260/230 <2.0, a’ nochdadh gum faodadh fuigheall ath-bheachdan organach a bhith ann an RNA, leithid phenols, ethanol no siùcaran.

Electrophoresis gel agarose:

Faodaidh measadh electrophoresis gel Agarose mion-sgrùdadh a dhèanamh air ionracas RNA, genoma agus fuigheall pròtain, ach chan urrainn dhaibh tomhas ceart a dhèanamh air dùmhlachd RNA no na tha air fhàgail de ath-bheachdan organach a lorg.Gabh teamplaidean RNA eukaryotic mar eisimpleir:

1. Bha an RNA fo smachd electrophoresis gel agarose.Mura robh ach trì bannan singilte de 28sRNA, 18sRNA agus 5.8sRNA air a’ mhapa gel, tha e a’ nochdadh gu bheil an RNA a chaidh a thoirt a-mach slàn.Ma tha iongantas slaodadh ann, tha e a’ nochdadh truailleadh pàirt de RNA.

2. Ma tha aon chòmhlan soilleir eadar an toll gluasaid agus an còmhlan 28sRNA, dh'fhaodadh gum bi fuigheall DNA genomic ann.

3. Ma nochdas bannan anns an toll gluasaid, tha e a 'sealltainn gum faodadh fuigheall pròtain agus stuthan macromolecular eile a bhith ann.

Ⅱ. Ath-sgrìobhadh air ais

Às deidh às-tharraing RNA a chrìochnachadh, feumar a thionndadh air ais gu cDNA airson deuchainnean às deidh sin, agus mar sin tha an ceum air ais riatanach.Thèid tar-sgrìobhadh air ais a thoirt a-steach bhon taghadh de chùl transcriptase agus primer:

Taghadh tar-sgrìobhaidh air ais:

Tha na tar-sgrìobhaidhean cùil àbhaisteach a’ toirt a-steach AMV RTase agus MMLV RTase.Tha gnìomhachd làidir aig an RNase H de AMV RTase, fad synthesis goirid, ìre synthesis ìosal agus seasmhachd teirmeach math (42 ~ 55 ℃).Tha gnìomhachd RNase H de MMLV RTase lag, tha an fhaid synthesis fada, tha an ìre synthesis àrd, agus tha an seasmhachd teirmeach truagh (37 ~ 42 ℃).

Leis gu bheil an gnìomh aig enzyme RNase H a bhith a’ lughdachadh teamplaid RNA, bu chòir MMLV le gnìomhachd RNase H lag a bhith air a thaghadh mar roghainn rè ath-sgrìobhadh cùil, agus às deidh innleadaireachd ginteil nas fhaide air adhart, tha seasmhachd teirmeach MMLV air leum càileachdail a ruighinn.A 'gabhail ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV airson ath-sgrìobhadh air ais) mar eisimpleir, is e transcriptase cùil ùr a th’ ann air a chuir an cèill ann am bacteria einnseanaichte E. coli a’ cleachdadh teicneòlas ath-mheasgachaidh ginteil.Is e DNA polymerase ath-chuingealaichte a th’ ann a bhios a’ dèanamh ceangal ri dualan DNA co-phàirteach bho RNA aon-shreath, DNA, no RNA: hibrid DNA.Chan eil gnìomhachd RNase H aige, seasmhachd làidir, dàimh làidir RNA, agus cugallachd lorg àrd.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV airson ath-sgrìobhadh air ais)

Taghadh de primer:

Mar as trice bidh primers RT a’ roinn ann an trì roinnean: oligo dT, primers air thuaiream, agus primers a tha sònraichte do ghine.Tagh primers iomchaidh airson an cleachdadh a rèir diofar riatanasan deuchainneach.

1. Ma tha an teamplaid de thùs eukaryotic agus gu bheil an cDNA fadalach air a chleachdadh airson leudachadh PCR àbhaisteach, thathar a 'moladh Oligo (dT);Mura tèid an deuchainn às deidh sin a chleachdadh ach airson qPCR, thathas a’ moladh Oligo (dT) a mheasgachadh le primers air thuaiream gus èifeachdas ath-sgrìobhadh cùil a leasachadh.

2. Ma tha an teamplaid bho prokaryotes, bu chòir Random Primer no ginean sònraichte primers a thaghadh airson ath-sgrìobhadh air ais.

Ⅲ.qPCR

Tha tomhas fluorescence air a mhìneachadh sa mhòr-chuid bho bhith a’ taghadh dhòighean cainneachdail, prionnsapalan dealbhaidh primer, taghadh ROX, rèiteachadh siostam freagairt agus suidheachadh suidheachadh freagairt, msaa.

Taghadh de dhòighean cainneachdail:

Tha modhan cainneachdail air an roinn ann an dòighean cainneachdail coimeasach agus dòighean cainneachdail iomlan.Faodar tomhas coimeasach a chleachdadh gus buaidh cuid de dhòighean làimhseachaidh air faireachdainn gine a lorg, eadar-dhealachadh faireachdainn gine a lorg aig amannan eadar-dhealaichte agus coimeas a dhèanamh eadar eadar-dhealachadh abairt gine ann an diofar fhigheagan.Faodaidh àireamhachadh iomlan na tha de dh’ searbhag niuclasach a lorg anns a’ bhìoras agus mar sin air adhart.Nuair a bhios sinn a’ dèanamh dheuchainnean, feumaidh sinn na dòighean cainneachdail iomchaidh a thaghadh a rèir ar deuchainnean fhèin.

Prionnsabalan dealbhaidh tùsail:

Tha dealbhadh primer airson qPCR ceangailte gu dìreach ri èifeachdas leudachaidh agus sònrachas toraidh.Mar sin, is e dealbhadh ceart primers math a’ chiad cheum de qPCR soirbheachail.Ann an dealbhadh primer, bu chòir aire a thoirt do na prionnsapalan a leanas nuair a thathar a’ coinneachadh ri prionnsapal dealbhadh gnàthach primer:

1. Tha fad a 'chriomag targaid air a smachdachadh eadar 100 agus 300 bp;

2. Dealbhadh tar-exon gus buaidh DNA genomic a sheachnadh;

3. Feumar na primers dealbhaichte a dhearbhadh airson èifeachdas leudachaidh, agus dìreach nuair a ruigeas an èifeachdas leudachaidh an ìre (90-110%) faodar an cleachdadh airson deuchainnean cainneachdail;

4. Mar as trice tha dùmhlachd primer air a mheudachadh eadar 0.1uM agus 1.0uM.

Taghadh deROX:

Ann am pròiseas ath-bhualadh cainneachdail, faodaidh ROX an eadar-dhealachadh slighe optigeach, mearachd pìobaireachd no eadar-dhealachadh tomhas-lìonaidh air adhbhrachadh le falmhachadh agus dùmhlachd atharrachadh gu èideadh, ag adhartachadh ath-aithris nan toraidhean.Ach, bu chòir a thoirt fa-near gu bheil an taghadh de ROX co-cheangailte ris an ionnstramaid.Ma tha an gnìomh aig an ionnstramaid qPCR an eadar-dhealachadh eadar tuill a cheartachadh gu fèin-ghluasadach, chan fheum e ROX a chuir ris;air dhòigh eile, feumaidh e ceartachadh ROX a chuir ris.Feumaidh com-pàirtichean beaga ann a bhith a 'ceannach ath-bheachdan a rèir an ionnstramaid a thathar a' cleachdadh gus an ROX ceart a thaghadh, seachain mearachdan nas fhaide air adhart.

Ag ullachadh an t-siostam freagairt:

Is fheàrr meudan freagairt de 20ul agus 50ul.Bu chòir aire a thoirt do na cùisean a leanas nuair a thèid an siostam a chruthachadh:

1. Feumaidh an siostam freagairt a bhith air ullachadh le fionnarachadh anns a 'bheing-obrach ultra-ghlan, ddH ùr₂Tha O air a chleachdadh airson gach deuchainn;

2. Feumaidh gach deuchainn NTC ullachadh gus dearbhadh a bheil truailleadh san t-siostam, agus feumaidh gach paidhir primers NTC a dhèanamh nuair a bhios an siostam ag ullachadh;

3. Gus faighinn a-mach a bheil fuigheall gDNA anns an teamplaid RNA, faodar NRT ullachadh airson gach sampall airson lorg;

4. Nuair a bhios tu ag ullachadh an t-siostaim, thathar a 'moladh co-dhiù 3 ath-aithris theicnigeach a dhèanamh airson aon sampall;

5. Nuair a tha an teamplaid cDNA, thathar a 'moladh a bhith a' lagachadh 5-10 tursan gus lùghdachadh a 'bhuaidh casg air siostam tar-sgrìobhaidh air ais air deuchainn qPCR.Tha e nas fheàrr meud an teamplaid a sgrùdadh le caisead, gus am bi luach CT a’ tuiteam eadar 20-30;

6. Obraich a-mach an àireamh de ath-bheachdan a tha a dhìth, àrdachadh le 5-10% air bunait an àireamh de ath-bheachdan, agus obrachadh a-mach an àireamh rèiteachaidh lìonaidh;

7, tha an siostam air ullachadh a’ cleachdadh prionnsapal premix, measgachadh às deidh centrifugation agus dèanamh cinnteach nach eil builgeanan ann;

8, Cho fad 's as urrainn dhut stuthan taice a thaghadh.

Kit RT-qPCR co-cheangailte