Bunait dealbhaidh primer (faodar duilgheadasan 99% fhuasgladh)
1. Primer faid: Feumaidh an leabhar-teacsa 15-30bp, mar as trice mu 20bp.Tha an suidheachadh fìor nas fheàrr a bhith 18-24bp gus dèanamh cinnteach à sònrachas, ach mar as fhaide as fheàrr, bidh primer ro fhada cuideachd a’ lughdachadh an sònrachas, agus a ’lughdachadh an toraidh.
2. Raon leudachaidh primer: tha 200-500bp iomchaidh, agus faodar an criomag a leudachadh gu 10kb fo chumhachan sònraichte.
3. Bunait primer: Bu chòir susbaint G+C a bhith 40-60%, ro bheag de bhuaidh leudachaidh G+C nach eil math, tha cus G+C furasta a bhith a’ nochdadh còmhlain neo-shònraichte.Tha e nas fheàrr ATGC a sgaoileadh air thuaiream, a’ seachnadh cruinneachaidhean de bharrachd air 5 nucleotides purine no pyrimidine.Ioma-gc airson na sreathan deireadh 5 ′ agus eadar-mheadhanach gus seasmhachd àrdachadh, seachain GC beairteach aig deireadh 3 ′, gun GC airson na 3 bunaitean mu dheireadh, no gun GC airson 3 de na 5 bonn mu dheireadh.
4. Seachain structar àrd-sgoile ann am primers, agus seachain co-lìonadh eadar dà primers, gu h-àraidh co-phàirteachadh aig deireadh 3 ', air neo thèid primer dimer a chruthachadh agus thèid bannan leudachaidh neo-shònraichte a chruthachadh.
5. Bu chòir na bunaitean aig deireadh 3 'prìomhairean, gu h-àraidh na h-ionadan mu dheireadh agus mu dheireadh, a bhith air an càradh gu cruaidh gus fàilligeadh PCR a sheachnadh mar thoradh air bunaitean crìochnachaidh gun chàradh.
6. Tha no faodar prìomhairean a chur ris le làraich sgoltadh iomchaidh, agus bu chòir gum biodh làraichean glanaidh iomchaidh aig an t-sreath targaid leudaichte, rud a tha gu math buannachdail airson mion-sgrùdadh cleavage no clonadh moileciuil.
7. Sònrachadh primers: cha bu chòir homology follaiseach a bhith aig primers le sreathan eile anns an stòr-dàta sreath searbhag nucleic.
8. Ionnsaich mar a chleachdas tu bathar-bog: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Tha an dealbhadh air-loidhne seo ag obair as fheàrr).
Faodaidh an susbaint gu h-àrd fuasgladh fhaighinn air co-dhiù 99% de dhuilgheadasan dealbhaidh primer.
Smachd a chumail air mion-fhiosrachadh dealbhadh primer
1. Fad primer
Is e fad primer coitcheann 18 ~ 30 bonn.San fharsaingeachd, is e fad an primer am bàillidh as cudromaiche a tha a’ dearbhadh teòthachd annealing an primer.Tha an teòthachd annealing de primer air a thaghadh sa chumantas (luach Tm -5 ℃), agus bidh cuid a’ cleachdadh luach Tm gu dìreach.Faodar na foirmlean a leanas a chleachdadh gus tuairmse a dhèanamh air teòthachd analachaidh primers.
Nuair a tha fad an primer nas lugha na 20bp: [4(G + C) + 2 (A + T)] -5 ℃
Nuair a tha fad an primer nas motha na 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / fad-5 ℃
A bharrachd air an sin, faodar mòran de bhathar-bog a chleachdadh cuideachd gus an teòthachd annealing obrachadh a-mach, bidh am prionnsapal àireamhachaidh eadar-dhealaichte, agus mar sin uaireannan is dòcha gum bi beàrn beag aig an luach àireamhaichte.Gus ath-bheachdan PCR a bharrachadh, thathas a’ cleachdadh na primers as giorra a nì cinnteach gu bheil teòthachd annealing nach eil nas ìsle na 54 ℃ airson an èifeachdas agus an sònrachas as fheàrr.
Gu h-iomlan, bidh sònrachas primer ag àrdachadh le factar de cheithir airson gach nucleotide a bharrachd, gus am bi an fhaid primer as ìsle airson a’ mhòr-chuid de thagraidhean 18 nucleotides.Chan eil crìoch àrd fad primer glè chudromach, gu sònraichte co-cheangailte ri èifeachdas ath-bhualadh.Air sgàth entropy, mar as fhaide a bhios am primer, is ann as ìsle a bhios an ìre aig a bheil e ag amas air ceangal ris an DNA targaid gus teamplaid seasmhach le dà shreath a chruthachadh airson DNA polymerase a cheangal.
Nuair a bhios tu a’ cleachdadh bathar-bog airson primers a dhealbhadh, faodar fad primers a dhearbhadh le luach TM mu seach, gu sònraichte airson primers de PCR cainneachdail fluorescence, bu chòir smachd a chumail air TM = 60 ℃ no mar sin.
2.GC susbaint
San fharsaingeachd, is e susbaint G + C ann an sreathan primer 40% ~ 60%, agus bu chòir susbaint GC agus luach Tm paidhir primers a cho-òrdanachadh.Ma tha fìor chlaonadh GC no AT aig a’ primer, faodar meud iomchaidh de earball A, T no G agus C a chur ri ceann 5’ a’ primer.
3. Annealing teòthachd
Bu chòir an teòthachd annealing a bhith 5 ℃ nas ìsle na an teòthachd unchain.Ma tha an àireamh de bhunaitean primer beag, faodar an teòthachd annealing àrdachadh gu h-iomchaidh, a dh’ fhaodadh sònrachas PCR a mheudachadh.Ma tha an àireamh de bhunaitean mòr, faodar an teòthachd annealing a lughdachadh gu h-iomchaidh.Cha toir an eadar-dhealachadh teòthachd annealing eadar paidhir primers de 4 ℃ ~ 6 ℃ buaidh air toradh PCR, ach gu h-iomchaidh tha an teòthachd annealing de phaidhir primers an aon rud, a dh’ fhaodadh a bhith eadar 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Seachain raon structair àrd-sgoile an teamplaid leudachaidh
Tha e nas fheàrr roinn structar àrd-sgoile an teamplaid a sheachnadh nuair a thaghas tu a’ chriomag leudaichte.Faodar structar seasmhach àrd-sgoile na criomag targaid a ro-innse agus a mheasadh le bathar-bog coimpiutair iomchaidh, a tha cuideachail airson taghadh teamplaid.Tha toraidhean deuchainneach a’ sealltainn nach eil an leudachadh gu tric soirbheachail nuair a tha an lùth an-asgaidh (△G) den roinn a tha ri leudachadh nas lugha na 58.6lkJ/mol.
5. Mì-chothromachadh le DNA targaid
Nuair a tha an t-sreath targaid DNA leudaichte mòr, faodaidh primer ceangal a dhèanamh ri grunn phàirtean den DNA targaid, agus mar thoradh air an sin nochdaidh grunn chòmhlain san toradh.An turas seo feumar deuchainn bathar-bog BLAST, làrach-lìn:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Tagh Co-thaobhadh dà shreath (bl2seq).
Tha e eadar-ghluasadach a bhith a’ cur seachad sreathan primer gu sòn 1 agus ag amas air sreathan DNA gu sòn 2, agus bidh BLAST a’ tomhas chothroman co-phàirteach, antisense agus eile, agus mar sin chan fheum luchd-cleachdaidh mothachadh a bheil an dà shlabhraidh nan slabhraidhean mothachaidh.Faodaidh tu cuideachd an àireamh GI a chur a-steach ma tha fios agad air àireamh GI an t-sreath san stòr-dàta, mar sin chan fheum thu earrann mhòr den t-sreath a phasgadh.Mu dheireadh, cliog Co-thaobhadh aig 3 gus faicinn a bheil grunn làraich homologous aig a’ phrìomhaire anns an DNA targaid.
6. Terminal primer
Is e an 3 'deireadh den primer far a bheil an leudachadh a' tòiseachadh, agus mar sin tha e cudromach casg a chur air mì-chothromachadh bho bhith a 'tòiseachadh an sin.Cha bu chòir crìoch 3 'a bhith nas fhaide na 3 G no C an dèidh a chèile, oir bidh seo ag adhbhrachadh gum bi am primer air a phiobrachadh le mearachd ann an roinn sreath beairteachaidh G+C.Chan urrainn don cheann 3 'structar àrd-sgoile sam bith a chruthachadh, ach a-mhàin ann an ath-bheachdan sònraichte PCR (AS-PCR), chan urrainnear deireadh 3' a' chiadaire a mhì-chothromachadh.Mar eisimpleir, ma tha an roinn còdaidh air a mheudachadh, cha bu chòir crìoch a chur air 3 'deireadh primer aig an treas suidheachadh de chodon, oir tha an treas suidheachadh codon buailteach a dhol sìos, a bheir buaidh air sònrachas agus èifeachdas leudachaidh.Nuair a bhios tu a’ cleachdadh primers annexation, thoir sùil air a’ chlàr cleachdadh codon, thoir aire do roghainn bith-eòlasach, na cleachd primers annexation aig deireadh 3 ′, agus cleachd dùmhlachd nas àirde de primers (1uM-3uM).
7. Structar àrd-sgoile de primers
Cha bu chòir sreathan co-phàirteach a bhith aig na primers fhèin, air neo bidh na primers fhèin a ’pasgadh a-steach do structaran fuilt, agus bheir an structar àrd-sgoile seo buaidh air ceangal primers agus teamplaidean mar thoradh air bacadh làidir.Ma thèid breithneachadh fuadain a chleachdadh, cha bu chòir bunaitean co-phàirteach leantainneach nan primers fhèin a bhith nas àirde na 3bp.Cha bu chòir co-fhreagarrachd sam bith a bhith eadar an dà primers, gu h-àraidh bu chòir an tar-lùbadh co-phàirteach de cheann 3 a sheachnadh gus casg a chuir air cruthachadh primer dimers.San fharsaingeachd, cha bu chòir gum biodh barrachd air 4 bunaitean leantainneach homology no co-fhreagarrachd eadar paidhir primers.
8. Cuir comharran no loci ris
Chan eil mòran buaidh aig deireadh 5 'air sònrachas leudachaidh agus mar sin faodar atharrachadh gun a bhith a' toirt buaidh air sònrachas leudachaidh.Bha mion-atharrachadh primer 5 'deireadh a' gabhail a-steach: làrach cuibhreachaidh enzyme a chur ris;Biotin le bileag, fluorescence, digoxin, Eu3+, msaa. Thoir a-steach sreathan DNA ceangail pròtain;A 'toirt a-steach làraichean mutation, a' cuir a-steach agus a 'call sreathan mutation agus a' toirt a-steach sreathan adhartachaidh, msaa. Bheir na bunaitean a bharrachd buaidh nas motha no nas lugha air èifeachdas leudachaidh agus àrdaichidh iad an cothrom air cruthachadh primer dimer, ach feumar cuid de lasachaidhean a dhèanamh airson an ath cheum.Faodar sreathan a bharrachd nach eil ann air an t-sreath targaid, leithid làraich cuibhreachaidh agus sreathan adhartachaidh, a chur ri deireadh 5 ′ den primer gun a bhith a’ toirt buaidh air sònrachas.Chan eil na sreathan sin air an gabhail a-steach ann an obrachadh a-mach luachan primer Tm, ach bu chòir an deuchainn airson co-fhreagarrachd agus structar àrd-sgoile a-staigh.
9. Fo-chluaintean
A’ mhòr-chuid den ùine, chan eil ann am PCR ach clonadh tòiseachaidh, agus an uairsin feumaidh sinn an criomag targaid a chuir a-steach gu diofar vectaran, agus mar sin feumaidh sinn bunaitean a bharrachd a dhealbhadh airson an ath ghnìomhachd sa cheum PCR.
Tha geàrr-chunntas gu h-ìosal air cuid de na sreathan a chaidh a dhealbhadh airson subcloning.
Chaidh làrach cuibhreachaidh endonuclease cuibhreachaidh a chur ris
Is e a bhith a’ cur làraich cuibhreachaidh enzyme ris an dòigh as cumanta airson toraidhean PCR a fho-ghlacadh.San fharsaingeachd, tha an làrach cleavage sia bunaitean, a bharrachd air an 5 'deireadh na làraich cleavage feumar 2 ~ 3 dìon bhunaitean a chur ris.Ach, tha an àireamh de bhunaitean dìon a dh 'fheumas diofar enzymes eadar-dhealaichte.Mar eisimpleir, chan fheum SalⅠ bunait dìon sam bith, feumaidh EcoRⅤ 1 ionad dìon, Chan fheum Ⅰ 2 ionad dìon, agus feumaidh Hind Ⅲ 3 bunaitean dìon.
Bidh LIC a 'cur ris an earball
Is e ainm slàn LIC clonadh Ligation-Independent, dòigh clonaidh a chaidh a chruthachadh le Navogen gu sònraichte airson a phàirt den vectar pET.Tha cinn steigeach aon-shreath bonn 12-15 neo-phàirteach aig a’ ghiùlan pET a chaidh ullachadh le modh LIC, a chuireas ris na cinn steigeach co-fhreagarrach air a’ chriomag cuir a-steach targaid.Airson adhbharan leudachaidh, bu chòir don t-sreath primer 5 ′ den chriomag a chaidh a chuir a-steach a dhol còmhla ris an vectar LIC.Faodaidh gnìomhachd extranect 3 ′ → 5 ′ de T4 DNA polymerase crìoch steigeach aon shreath a chruthachadh air a’ chriomag a chaidh a chuir a-steach às deidh ùine ghoirid.Leis nach urrainnear an toradh a chruthachadh ach bho bhith a’ annealing a’ chriomag cuir a-steach ullaichte agus an vectar, tha an dòigh seo gu math luath agus èifeachdach, agus tha e air a stiùireadh le clonadh.
Clone TA air a stiùireadh cuir earball
Cha b’ urrainn dha clonadh TA an criomag a chuimseachadh air vectar, agus mar sin an dèidh sin thug Invitrogen a-steach vectar a dh’ fhaodadh a bhith ag amas air clonadh, anns an robh ceithir bun-stèidh GTGGS aig aon cheann.Mar sin, ann an dealbhadh primers PCR, bu chòir sreathan co-phàirteach a chur ris a rèir sin, gus an tèid na criomagan “a stiùireadh”.
Ma tha thu goirid ann an ùine, faodaidh tu feuchainn air synthesis dìreach, a’ cothlamadh a’ ghine leis an vectar, ris an can sinn synthesis gine ET ann am fèitheachan.
D. Modh clonaidh In-Fusion
Chan eil feum air ligase, chan eil feum air freagairt fada.Cho fad ‘s a thèid sreath aig gach ceann den vectar sreathach a thoirt a-steach Ann an dealbhadh primers, an uairsin thèid an toradh PCR agus an vectar sreathach a chuir a-steach don fhuasgladh enzyme in-fusion anns a bheil BSA agus a chuir aig teòthachd an t-seòmair airson leth uair a thìde, faodar an cruth-atharrachadh a dhèanamh.Tha an dòigh seo gu sònraichte freagarrach airson tionndadh meud mòr.
10. Merge primer
Aig amannan, chan eil ach beagan fiosrachaidh ann an sreath mu dhealbhadh primer.Mar eisimpleir, mura h-eil fios ach air an t-sreath aminoideach, faodar am primer aonaichte a dhealbhadh.Is e measgachadh de shreathan eadar-dhealaichte a th’ ann am primer aonaidh a tha a’ riochdachadh na diofar chothroman bunaiteach a tha a’ còdachadh aon aminoideach.Gus sònrachas àrdachadh, faodaidh tu iomradh a thoirt air a’ chlàr cleachdaidh codon gus ceangaltas a lughdachadh a rèir roghainnean cleachdadh bunaiteach de dhiofar fhàs-bheairtean.Faodar Hypoxanthine a chàradh leis na h-ionadan gu lèir gus teòthachd analachaidh an primer a lughdachadh.Na cleachd na h-ionadan ceangailte aig deireadh 3 ′ den primer oir tha annealing nan 3 ionadan mu dheireadh aig ceann 3 ′ gu leòr airson PCR a thòiseachadh aig an làrach cheàrr.Bithear a’ cleachdadh dùmhlachdan primer nas àirde (1μM gu 3μM) leis nach eil primers ann am mòran mheasgachaidhean ceangail sònraichte don teamplaid targaid.
PCR stuthan amhsmachd
1. Primer meud
Is e dùmhlachd gach primer 0.1 ~ 1umol no 10 ~ 100pmol.Tha e nas fheàrr an toradh a tha a dhìth a thoirt gu buil leis an ìre as lugha de primer.Bidh dùmhlachd àrd de primer ag adhbhrachadh mì-chothromachadh agus leudachadh neo-shònraichte, agus àrdaichidh e an cothrom gun tèid dimers a chruthachadh eadar primers.
2. Primer dùmhlachd
Bidh an dùmhlachd de primers a’ toirt buaidh air sònrachas.Tha an dùmhlachd primer as fheàrr sa chumantas eadar 0.1 agus 0.5 μM.Bidh dùmhlachd primer nas àirde a’ leantainn gu leudachadh air toraidhean neo-shònraichte.
3. Annealing teòthachd primer
Is e paramadair cudromach eile airson primers an teòthachd leaghaidh (Tm).Is e seo an teòthachd nuair a tha 50% de na primers agus na sreathan co-phàirteach air an riochdachadh mar mholacilean DNA le sreathan dùbailte.Tha feum air Tm gus teòthachd analachaidh PCR a shuidheachadh.Mas fheàrr, tha an teòthachd annealing ìosal gu leòr gus dèanamh cinnteach gu bheil na primers air an cur an sàs gu h-èifeachdach leis an t-sreath targaid, ach àrd gu leòr airson ceangal neo-shònraichte a lughdachadh.Teòthachd annealing reusanta bho 55 ℃ gu 70 ℃.Tha an teòthachd annealing mar as trice air a shuidheachadh 5 ℃ nas ìsle na Tm de primer.
Tha grunn fhoirmlean ann airson suidheachadh Tm, a tha ag atharrachadh gu mòr a rèir na foirmle a thathar a 'cleachdadh agus an t-sreath de phrìomhairean.Leis gu bheil a’ mhòr-chuid de fhoirmlean a’ toirt seachad luach Tm measta, chan eil anns a h-uile teòthachd analachaidh ach toiseach tòiseachaidh.Faodar sònrachas a leasachadh le bhith a’ dèanamh anailis air grunn ath-bheachdan a bhios mean air mhean ag àrdachadh an teòthachd annealing.Tòisich nas ìsle na an tuairmse Tm-5 ℃, agus mean air mhean àrdaich an teòthachd annealing ann an àrdachadh de 2 ℃.Lùghdaichidh teòthachd annealing nas àirde cruthachadh primer dimers agus toraidhean neo-shònraichte.Airson na builean as fheàrr, bu chòir luachan Tm tuairmseach a bhith aig an dà phrìomhaire.Ma tha an eadar-dhealachadh Tm de chàraidean primer nas àirde na 5 ℃, seallaidh na primers tòiseachadh meallta mòr le bhith a’ cleachdadh teòthachd annealing nas ìsle sa chearcall.Ma tha an dà primers Tm eadar-dhealaichte, suidhich an teòthachd annealing gu 5 ℃ nas ìsle na an Tm as ìsle.Air an làimh eile, gus sònrachas àrdachadh, faodar còig cuairtean a dhèanamh an-toiseach aig teodhachd annealing a chaidh a dhealbhadh airson Tm nas àirde, air a leantainn leis na cuairtean a tha air fhàgail aig teòthachd annealing a chaidh a dhealbhadh airson Tm nas ìsle.Leigidh seo le leth-bhreac den teamplaid ceann-uidhe fhaighinn fo chumhachan teann.
4. Primer purity agus seasmhachd
Tha purrachd àbhaisteach primers àbhaisteach iomchaidh airson a ’mhòr-chuid de thagraidhean PCR.Chan eil ach glè bheag de thoirt air falbh buidhnean benzoyl agus isobutylyl le bhith a’ dì-sailleadh agus mar sin chan eil e a’ cur bacadh air PCR.Feumaidh cuid de thagraidhean glanadh gus sreathan neo-iomlan a thoirt air falbh sa phròiseas synthesis.Tha na sreathan truncated seo a’ tachairt leis nach eil èifeachdas ceimigeachd synthesis DNA 100%.Is e pròiseas cruinn a tha seo a bhios a’ cleachdadh ath-bheachdan ceimigeach a-rithist leis gu bheil gach bonn air a chur ris gus DNA a dhèanamh bho 3 ′ gu 5 ′.Faodaidh tu fàiligeadh anns gach cearcall.Tha cuibhreann mòr de shreathan gearraichte aig primers nas fhaide, gu h-àraidh an fheadhainn a tha nas motha na bunaitean 50, agus is dòcha gum feum iad glanadh.
Tha èifeachdas ceimigeachd synthetigeach agus modh glanaidh a’ toirt buaidh air toradh primers.Bidh companaidhean biopharmaceutical, leithid Cytology agus Shengong, uile a’ cleachdadh aonad OD as ìsle gus dèanamh cinnteach à toradh iomlan oligonucleoside.Bidh primers gnàthaichte air an cur ann an cruth pùdar tioram.Tha e nas fheàrr na primers ath-sgaoileadh ann an TE gus am bi an dùmhlachd deireannach 100 μM.Tha TE nas fheàrr na uisge deionized oir tha pH uisge gu tric searbhagach agus adhbharaichidh e uisgeachadh oligonucleosides.
Tha seasmhachd primers an urra ri suidheachaidhean stòraidh.Bu chòir pùdar tioram agus primers sgaoilte a bhith air an stòradh aig -20 ℃.Faodar primers sgaoilte ann an TE aig dùmhlachd nas motha na 10μM a stòradh gu seasmhach aig -20 ℃ airson 6 mìosan, ach chan urrainnear an stòradh ach aig teòthachd an t-seòmair (15 ℃ gu 30 ℃) airson nas lugha na 1 seachdain.Faodar primers pùdar tioram a stòradh aig -20 C airson co-dhiù 1 bliadhna agus aig teòthachd an t-seòmair (15 C gu 30 C) airson suas ri 2 mhìos.
5. Einnseanan agus an dùmhlachd
Aig an àm seo, is e an Taq DNA polymerase a thathas a’ cleachdadh gu bunaiteach an einnsean innleadaireachd gine air a cho-chur le bacteria coliform.Tha an ìre de enzyme a dh’ fheumar gus freagairt àbhaisteach PCR a chatalachadh timcheall air 2.5U (a ’toirt iomradh air an àireamh freagairt iomlan de 100ul).Ma tha an dùmhlachd ro àrd, faodaidh e leantainn gu leudachadh neo-shònraichte;ma tha an dùmhlachd ro ìosal, thèid an ìre de thoraidhean synthetigeach a lughdachadh.
6. Càileachd agus dùmhlachd dNTP
Tha càileachd dNTP ceangailte gu dlùth ri dùmhlachd agus èifeachdas àrdachadh PCR.Tha am pùdar dNTP granular, agus bidh an caochlaideachd aige a’ call a ghnìomhachd bith-eòlasach ma tha e air a stòradh gu neo-iomchaidh.Tha fuasgladh dNTP searbhagach, agus bu chòir a chleachdadh ann an dùmhlachd àrd, le fuasgladh bufair 1M NaOH no 1M Tris.HCL gus a PH atharrachadh gu 7.0 ~ 7.5, beagan fo-phacaidh, stòradh reòta aig -20 ℃.Bidh ioma-reothadh-leaghadh a’ lughdachadh dNTP.Ann am freagairt PCR, bu chòir dNTP a bhith 50 ~ 200umol / L.Gu sònraichte, bu chòir aire a thoirt do cho-chruinneachadh nan ceithir DNTPS a bhith co-ionann (ullachadh co-ionann moile).Ma tha dùmhlachd aon dhiubh eadar-dhealaichte bhon fheadhainn eile (nas àirde no nas ìsle), thèid mì-chothromachadh adhbhrachadh.Lùghdaichidh dùmhlachd ro ìosal toradh thoraidhean PCR.Faodaidh dNTP a dhol còmhla ri Mg2+ agus an dùmhlachd de Mg2+ an-asgaidh a lughdachadh.
7. Teamplaid (gine targaid) nucleic acid
Is e meud agus ìre glanaidh searbhag niuclasach teamplaid aon de na prìomh cheanglaichean airson soirbheachas no fàilligeadh PCR.Mar as trice bidh na dòighean glanaidh DNA traidiseanta a’ cleachdadh SDS agus protease K gus sampallan a chnàmh agus a chuir air falbh.Is e prìomh dhleastanasan SDS: lipids agus pròtanan a sgaoileadh air an memblan cealla, mar sin a’ sgrios na memblan cealla le bhith a ’leaghadh pròtanan membran, agus a’ cuir às do phròtainean niùclasach sa chill, faodaidh SDS cuideachd a dhol còmhla ri pròtanan agus sileadh;Faodaidh Protease K pròtanan a uisgeachadh agus a chnàmh, gu h-àraidh histones ceangailte le DNA, agus an uairsin a’ cleachdadh phenol solvent organach agus cloroform gus pròtanan agus co-phàirtean cealla eile a thoirt a-mach, agus ethanol no alcol isopropyl a chleachdadh gus searbhag niuclasach a dhùsgadh.Faodar an searbhag niuclasach a chaidh a thoirt a-mach a chleachdadh mar theamplaid airson ath-bheachdan PCR.Airson sampallan lorg clionaigeach coitcheann, faodar dòigh luath is sìmplidh a chleachdadh gus ceallan a sgaoileadh, pathogens a lysate, pròtanan a chnàmh agus a thoirt air falbh bho chromosomes gu ginean targaid an-asgaidh, agus a chleachdadh gu dìreach airson leudachadh PCR.Mar as trice bidh às-tharraing teamplaid RNA a’ cleachdadh modh guanidine isothiocyanate no protease K gus casg a chuir air RNase bho bhith a’ lughdachadh RNA.
8.Mg2+ dùmhlachd
Tha buaidh mhòr aig Mg2+ air sònrachas agus toradh leudachadh PCR.Ann am freagairt PCR san fharsaingeachd, nuair a tha an dùmhlachd de dhiofar dNTP 200umol/L, is e an dùmhlachd iomchaidh de Mg2+ 1.5 ~ 2.0mmol/L.Tha dùmhlachd Mg2+ ro àrd, bidh sònrachas an ath-bhualadh a’ dol sìos, bidh leudachadh neo-shònraichte a’ tachairt, lughdaichidh dùmhlachd ro ìosal gnìomhachd Taq DNA polymerase, a’ leantainn gu lughdachadh ann an toraidhean freagairt.
Bidh ions magnesium a’ toirt buaidh air grunn thaobhan de PCR, leithid gnìomhachd DNA polymerase, a bheir buaidh air toradh;Is e eisimpleir eile annealing primer, a bheir buaidh air sònrachas.Bidh dNTP agus teamplaid a’ ceangal ri ion magnesium, a’ lughdachadh na tha de ian magnesium an-asgaidh a dh’ fheumar airson gnìomhachd enzyme.Bidh an dùmhlachd ion magnesium as fheàrr ag atharrachadh airson diofar chàraidean agus teamplaidean primer, ach is e dùmhlachd tòiseachaidh PCR àbhaisteach le 200μM dNTP 1.5mM (nota: Airson PCR cainneachdail fìor-ùine, cleachd fuasgladh ian magnesium 3 gu 5mM le probe flùraiseach).Bidh co-chruinneachaidhean nas àirde de ianan magnesium an-asgaidh a 'meudachadh toradh, ach cuideachd a' meudachadh meudachadh neo-shònraichte agus a 'lùghdachadh dìlseachd.Gus an dùmhlachd as fheàrr a dhearbhadh, chaidh titrations ion magnesium a dhèanamh ann an àrdachaidhean de 0.5mM bho 1mM gu 3mM.Gus an eisimeileachd air optimization ion magnesium a lughdachadh, faodar Platinum Taq DNA polymerase a chleachdadh.Tha Platinum Taq DNA polymerase comasach air gnìomh a chumail thairis air raon nas fharsainge de cho-chruinneachaidhean ian magnesium na Taq DNA polymerase agus mar sin tha feum air nas lugha de optimization.
9. Pcr-brosnachadh cur-ris
Tha àrdachadh teòthachd annealing, dealbhadh primer, agus dùmhlachd ion magnesium gu leòr airson leudachadh sònraichte air a’ mhòr-chuid de theamplaidean;ach, tha cuid de theamplaidean, a’ gabhail a-steach an fheadhainn le susbaint àrd GC, a’ feumachdainn ceumannan a bharrachd.Tha stuthan cur-ris a bheir buaidh air teòthachd leaghaidh DNA a’ toirt seachad dòigh eile air sònrachas toraidh agus toradh a leasachadh.Tha feum air dì-nàdarachadh iomlan den teamplaid airson na builean as fheàrr.
A bharrachd air an sin, tha an structar àrd-sgoile a ’cur casg air ceangal primer agus leudachadh enzyme.
Bidh cuiridhean PCR, a 'gabhail a-steach formamide, DMSO, glycerin, betaine, agus PCRx Enhancer Solution, ag àrdachadh leudachadh.Is e an dòigh a dh’ fhaodadh a bhith aca an teòthachd leaghaidh a lughdachadh, mar sin a’ toirt taic do bhith ag àrach primers agus a’ cuideachadh le leudachadh DNA polymerase tro roinn an structair àrd-sgoile.Tha buannachdan eile aig PCRx Solution.Tha feum air optimization ian magnesium as ìsle nuair a thèid a chleachdadh le Platinum Taq DNA polymerase agus Platinum Pfx DNA polymerase.Mar sin, tha an dòigh Platinum air a chur còmhla ris an stuth cur-ris gus sònrachas àrdachadh fhad ‘s a tha e a’ lughdachadh eisimeileachd an treas dòigh-obrach, optimization ion magnesium.Airson na builean as fheàrr, bu chòir an cruinneachadh de stuthan cur-ris a mheudachadh, gu sònraichte DMSO, formamide, agus glycerol, a tha a’ cur bacadh air Taq DNA polymerase.
10. Tòiseachadh teth
Is e tòiseachadh teth PCR aon de na dòighean as cudromaiche gus sònrachas PCR a leasachadh a bharrachd air deagh dhealbhadh primer.Ged is e an teòthachd leudachaidh as fheàrr de Taq DNA polymerase 72 ℃, tha am polymerase fhathast gnìomhach aig teòthachd an t-seòmair.Mar sin, thèid toraidhean neo-shònraichte a thoirt a-mach nuair a tha an teòthachd cumail nas ìsle na an teòthachd annealing rè ullachadh an ath-bhualadh PCR agus aig toiseach a’ chearcall teirmeach.Aon uair ‘s gu bheil iad air an cruthachadh, tha na toraidhean neo-shònraichte sin air an àrdachadh gu h-èifeachdach.Tha PCR tòiseachaidh teth gu sònraichte èifeachdach nuair a tha na làraich a thathas a’ cleachdadh airson dealbhadh primer air an cuingealachadh le suidheachadh eileamaidean ginteil, leithid mùthaidhean air an stiùireadh le làrach, clonadh faireachdainn, no togail agus làimhseachadh eileamaidean ginteil a thathas a’ cleachdadh airson innleadaireachd DNA.
Is e dòigh cumanta air gnìomhachd Taq DNA polymerase a chuingealachadh fuasgladh freagairt PCR ullachadh air deigh agus a chuir ann an inneal PCR ro-theasachadh.Tha an dòigh seo sìmplidh agus saor, ach chan eil e a 'crìochnachadh gnìomhachd an enzyme agus mar sin chan eil e gu tur a' cur às do leudachadh air stuthan neo-shònraichte.
Bidh prìomhadh teirmeach a’ cur dàil air synthesis DNA le bhith a’ cur bacadh air pàirt riatanach gus an ruig an inneal PCR teòthachd dì-nàdurrach.Tha a’ mhòr-chuid de dhòighean tòiseachaidh teirmeach làimhe, a’ toirt a-steach dàil air cuir a-steach Taq DNA polymerase, trom, gu sònraichte airson tagraidhean àrd-thoradh.Bidh dòighean priming teirmeach eile a’ cleachdadh sgiath cèir gus pàirt riatanach a chuartachadh, a’ toirt a-steach ianan magnesium no enzyman, no gus co-phàirtean reactive a sgaradh gu corporra, leithid teamplaidean agus bufairean.Rè a 'chearcall teirmeach, bidh na diofar phàirtean air an leigeil ma sgaoil agus air an measgachadh còmhla mar a bhios an cèir a' leaghadh.Coltach ris an dòigh tòiseachaidh teth làimhe, tha an dòigh sgiath cèir trom agus buailteach a bhith air a thruailleadh agus chan eil e freagarrach airson tagraidhean àrd-chuir.
Tha DNA polymerase Platinum goireasach agus èifeachdach airson tòiseachadh teth fèin-ghluasadach PCR.Tha Platinum Taq DNA polymerase air a dhèanamh suas de Taq DNA polymerase ath-leasaichte còmhla ri antibody monoclonal an aghaidh Taq DNA polymerase.Tha na antibodies air an cruthachadh le PCR gus casg a chuir air gnìomhachd enzyme rè cumail teòthachd fada.Chaidh Taq DNA polymerase a leigeil ma sgaoil a-steach don ath-bhualadh rè insulation 94 ℃ den cheum dì-nàdurrach, ag ath-nuadhachadh gnìomhachd làn polymerase.An coimeas ri Taq DNA polymerase a chaidh atharrachadh gu ceimigeach airson tòiseachadh teirmeach, chan fheum enzyme Platinum insulation fada aig 94 ℃ (10 gu 15 mionaidean) gus am polymerase a chuir an gnìomh.Le PlatinumTaq DNA polymerase, chaidh 90% de ghnìomhachd Taq DNA polymerase ath-nuadhachadh às deidh 2 mhionaid aig 94 ℃.
11. Nead-PCR
Faodaidh cuairtean leudachaidh leantainneach le bhith a’ cleachdadh primers neadachaidh feabhas a thoirt air sònrachas agus cugallachd.Tha a’ chiad chuairt na leudachadh àbhaisteach de 15 gu 20 cearcall.Chaidh bloigh bheag den chiad toradh leudachaidh a lagachadh 100 gu 1000 uair agus a chur ris an dàrna cuairt de leudachadh airson 15 gu 20 cearcall.Air an làimh eile, faodar an toradh àrdaichte tùsail a mheudachadh le glanadh gel.Tha primer neadachaidh air a chleachdadh anns an dàrna cuairt de leudachadh, a dh'fhaodas ceangal ris an t-sreath targaid taobh a-staigh a 'chiad primer.Tha cleachdadh PCR neadachaidh a’ lùghdachadh comas leudachadh air grunn làraich targaid leis nach eil ach glè bheag de shreathan targaid ann a tha a’ cur ris an dà sheata de primers.Mheudaich an aon àireamh iomlan de chuairtean (30 gu 40) leis na h-aon primers na làraich neo-shònraichte.Bidh PCR neadaichte a’ meudachadh cugallachd sreathan targaid cuibhrichte (me, mrnas tearc) agus a’ leasachadh sònraichteachd PCRS duilich (me 5 ′ RACE).
12. PCR a' teàrnadh
Le bhith a’ teàrnadh PCR a’ leasachadh sònrachas le bhith a’ cleachdadh suidheachaidhean teann analachaidh airson a’ chiad beagan chuairtean de PCR.Bidh an cearcall a’ tòiseachadh aig teòthachd annealing timcheall air 5 ℃ nas àirde na an tuairmse Tm, an uairsin thèid gach cearcall a lughdachadh 1 ℃ gu 2 ℃ gus am bi an teòthachd annealing nas ìsle na Tm 5 ℃.Is e dìreach an teamplaid ceann-uidhe leis an homology as àirde a thèid a mheudachadh.Tha na toraidhean sin a’ leantainn air adhart a’ leudachadh ann an cearcallan às deidh sin, a’ toirt a-mach toraidhean neo-shònraichte leudaichte.Tha teàrnadh PCR feumail airson dòighean far nach eil fios dè an ìre de homology eadar primer agus teamplaid targaid, leithid lorgan-meòir DNA AFLP.
Innealan PCR co-cheangailte
An Gaisgeach 2 × PCRTMTha fulangas nas àirde aig siostam Mix ri luchd-dìon PCR na an siostam àbhaisteach PCR Mix, agus is urrainn dha dèiligeadh gu furasta ri leudachadh PCR air diofar theamplaidean iom-fhillte.Tha an siostam ath-bhualadh sònraichte agus Taq Hero àrd-èifeachdais a’ toirt air an fhreagairt PCR gu bheil èifeachdas leudachaidh nas àirde, sònrachas agus cugallachd.
Èifeachdas leudachaidh nas àirde
Tha gnìomhachd DNA polymerase 5'→3' aige agus gnìomhachd exonuclease 5'→3', às aonais gnìomhachd exonuclease 3'→ 5'.
Fìor-ùine PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Faodaidh bufair sònraichte-leasaichte agus enzyme Taq tòiseachadh teth casg a chuir air leudachadh neo-shònraichte agus cruthachadh primer dimer
Àrd cugallachd - lorg lethbhric ìosal den teamplaid
Bidh an cromag a’ cleachdadh ath-aithris tar-sgrìobhaidh cùil Foregene gun samhail agus Foregene HotStar Taq DNA Polymerase còmhla ri siostam freagairt gun samhail gus èifeachdas leudachaidh agus sònrachas an ath-bhualadh adhartachadh gu h-èifeachdach.
Ùine puist: Cèitean-09-2023
