Sònrachadh lorgaidh

Anns a 'mhòr-chuid de chùisean, is e adhbhar dealbhadh primer a bhith a' meudachadh sònrachas PCR.Tha seo air a dhearbhadh leis a’ bhuaidh a tha gu ìre mhòr ro-innseach aig mòran chaochladairean.Is e aon caochladair cudromach an t-sreath aig deireadh 3 ′ den primer.

Gu cudromach, tha measaidhean PCR air an dealbhadh airson sònrachas nas dualtaiche àrd-èifeachdas a chumail thairis air raon fiùghantach farsaing, leis nach eil an assay a’ toirt a-mach toraidhean leudachaidh neo-shònraichte, mar sin a’ farpais ri ath-bheachdan PCR no a’ cur bacadh air a’ phrìomh fhreagairt leudachaidh.

Gu dearbh, ann an cuid de chùisean, chan e sònrachas an rud as cudromaiche, mar eisimpleir, nuair a tha e na amas tomhas a dhèanamh air pathogens dlùth-cheangailte ach eadar-dhealaichte, tha feum air inbhean dealbhaidh, optimization agus dearbhaidh sònraichte.

Tha an lùb leaghaidh na dhòigh àbhaisteach airson measadh a dhèanamh air sònrachas amplicons, co-dhiù a thaobh am bu chòir aon targaid àrdachadh.Ach, feumar a dhaingneachadh gum faod na lùban leaghaidh a bhith meallta oir, mar eisimpleir, faodaidh iad buaidh a thoirt air buaidhean co-cheangailte primers suboptimal agus dùmhlachd teamplaid ìosal.

P5 |Tha an lùb leaghaidh a’ sealltainn na gluasadan Tm a gheibhear bho dhà lorg de dhiofar mheudan de dhà DNA targaid.

A. Aig co-chruinneachaidhean nas àirde (ad)), chan eil dimer primer follaiseach ann às deidh an tomhas qPCR a chrìochnachadh.Mar a bhios dùmhlachd an teamplaid a’ dol sìos gu 50 leth-bhreac (e), bidh toradh neo-shònraichte a’ tòiseachadh a’ nochdadh agus a’ tighinn gu bhith mar an aon toradh aig an ìre as ìsle (f).

B. Chlàr an deuchainn na h-aon Tms aig a h-uile ìre targaid, agus cha robh primer dimer follaiseach eadhon aig an ìre as ìsle (5 leth-bhreac).Nuair a chaidh an dà dhòigh lorgaidh seo a chleachdadh, cha deach toraidhean leudachaidh sam bith a lorg ann an NTCn.

Tha P5 a’ sealltainn na lùban sgaoilidh a gheibhear le sampaill anns a bheil an teamplaid an làthair aig diofar chruinneachaidhean.Tha P 5a a’ sealltainn, aig an dà cho-chruinneachadh as ìsle, gu bheil Tms nan toraidhean leudachaidh neo-shònraichte a chaidh a thoirt a-mach nas ìsle na amplicons sònraichte.

Gu follaiseach, chan urrainnear an dòigh lorgaidh seo a chleachdadh gu earbsach gus targaidean a lorg a tha ann an dùmhlachd ìosal.

Gu inntinneach, cha do chlàraich NTCn, ie, sampaill gun DNA idir, toraidhean leudachaidh (neo-shònraichte), a’ nochdadh gum faod DNA genomic cùl-fhiosrachaidh pàirt a ghabhail ann an leudachadh / polymerization neo-shònraichte.

Aig amannan chan urrainnear an leithid de phrìomhairean cùl-fhiosrachaidh agus leudachadh neo-shònraichte a cheartachadh, ach gu tric tha e comasach dòigh lorgaidh a dhealbhadh aig nach eil leudachadh neo-shònraichte ann an dùmhlachd teamplaid sam bith agus NTC (P 5b).

An seo, bheir eadhon a bhith a’ clàradh leudachadh air a’ cho-chruinneachadh targaid le Cq de 35 lùb sgaoilidh sònraichte.San aon dòigh, cha do nochd NTCn comharran sam bith de leudachadh neo-shònraichte.Aig amannan, dh’ fhaodadh gum bi an giùlan lorgaidh an urra ri deoch-làidir na màthar, agus chan eil ach leudachadh neo-shònraichte air a lorg ann an cuid de sgrìobhaidhean bufair, a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri diofar cho-chruinneachaidhean Mg2+.

Seasmhachd lorgaidh

Tha optimization Ta na cheum feumail anns a’ phròiseas dearbhaidh empirigeach agus optimization de lorg qPCR.Tha e a 'toirt seachad comharradh dìreach air dè cho làidir' sa tha an t-seata primer le bhith a 'sealltainn an teòthachd (no an raon teòthachd) a chruthaicheas an Cq as ìsle gun a bhith ag àrdachadh an NTC.

Is dòcha nach eil an eadar-dhealachadh dà gu ceithir-fhillte ann an cugallachd cudromach dha daoine le faireachdainn mRNA àrd, ach airson deuchainnean breithneachaidh, dh’ fhaodadh e a bhith a’ ciallachadh an eadar-dhealachadh eadar toraidhean àicheil adhartach is meallta.

Faodaidh feartan Ta primers qPCR atharrachadh gu mòr.Chan eil cuid de dheuchainnean gu math làidir, agus mura tèid an coileanadh fon luach Ta as fheàrr de na primers, tuitidh iad gu sgiobalta.

Tha seo cudromach leis gu bheil an seòrsa lorg seo gu tric na dhuilgheadas san fhìor shaoghal, agus is dòcha nach bi purrachd an t-sampall, dùmhlachd DNA, no làthaireachd DNA eile cho math.

A bharrachd air an sin, faodaidh an àireamh leth-bhreac targaid a bhith eadar-dhealaichte ann an raon farsaing, agus faodaidh na h-ath-bheachdan, innealan plastaig, no ionnstramaidean a bhith eadar-dhealaichte bhon fheadhainn a thathas a’ cleachdadh nuair a thathar a’ stèidheachadh na deuchainn.

P6 | Tha an caisead teòthachd a’ sealltainn cho làidir sa tha lorg PCR.

A. Cleachd Mastermix Sensifast SYBR aig Bioline (àireamh catalog BIO-98050) gus PCR a dhèanamh air cDNA air ullachadh bho RNA eanchainn daonna.

B. Cleachd ionnstramaid CFX qPCR aig Bio-Rad gus mapa leudachaidh agus lùb sgaoilidh apalene a chlàradh (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Graf leudachaidh agus lùb leaghaidh de ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Graf leudachaidh agus lùb sgaoilidh GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs air a chlàradh aig teòthachd eadar-dhealaichte annealing, a 'sealltainn an eadar-dhealachadh ann an Cq a chaidh a chlàradh fo caisead teòthachd 7C.

Tha P 6 a’ sealltainn toradh àbhaisteach de dheuchainn neo-mhiannach, far an deach qPCR a dhèanamh a’ cleachdadh caisead Tas eadar 59C agus 67C (P 6a), a’ cleachdadh primers airson trì ginean daonna-sònraichte.

Chithear bhon ghraf leudachaidh gu bheil primers Opalin fada bho bhith air leth freagarrach leis gu bheil an raon Ta as fheàrr aca gu math cumhang (Figear 6b), is e sin, tha Cqs sgapte gu farsaing, a’ ciallachadh gu bheil Cqs gu mòr an coimeas ris na Cqs Ìosal as fheàrr aca.

Tha an dòigh lorgaidh seo neo-sheasmhach agus dh’ fhaodadh sin leantainn gu leudachadh suboptimal.Mar sin, bu chòir am paidhir primers seo ath-dhealbhadh.A bharrachd air an sin, tha mion-sgrùdadh lùb leaghaidh (seat) a’ sealltainn gum faodadh duilgheadas a bhith aig sònrachas an dòigh lorgaidh seo, leis gu bheil lùb leaghaidh gach Ta eadar-dhealaichte.

Tha an dòigh lorgaidh ACSBG1 a chithear ann am P 6c nas làidire na an dòigh lorgaidh Opalin gu h-àrd, ach tha e fhathast fada bho bhith air leth freagarrach, agus tha coltas ann gun gabh a leasachadh.

Ach, tha sinn a’ daingneachadh nach eil ceangal riatanach eadar neart agus sònrachas, leis gu bheil an lùb sgaoilidh a chaidh a thoirt a-mach leis an dòigh lorgaidh seo a’ nochdadh an aon luach as àirde anns a h-uile Tas (insset).

Air an làimh eile, tha an deuchainn neart mòran nas fulangaiche, a’ toirt a-mach Cqs coltach ri chèile ann an raon farsaing de Tas, mar a tha anns an deuchainn GFAP a chithear ann am P 6d.

Tha an eadar-dhealachadh ann an Cqs a gheibhear anns an aon raon 8 ceum Celsius nas lugha na 1, agus tha an lùb sgaoilidh (inset) a’ dearbhadh feartan lorgaidh san raon teòthachd seo.Is fhiach a bhith mothachail gum faod an àireamh Tas agus an fhìor raon Ta a bhith gu math eadar-dhealaichte.

Tha mòran stiùiridhean air an dealbhadh gus luchd-rannsachaidh a chuideachadh le bhith a’ dealbhadh primers èifeachdach, a ’mhòr-chuid dhiubh stèidhichte air riaghailtean a tha stèidhichte o chionn fhada agus chaidh mòran aire a thoirt do 3 ′deireadh na primers.Thathas gu tric a’ moladh G no C a thoirt a-steach aig ceann 3’ agus dà bhonn G no C (clamp GC), ach gun a bhith nas fhaide na dhà de na 5 bonn mu dheireadh.

Ann an cleachdadh, faodaidh na riaghailtean sin luchd-rannsachaidh a stiùireadh, ach chan eil iad gu riatanach ceart anns a h-uile suidheachadh.

P7 |Chan eil mòran buaidh aig deireadh 3 ′ den primer air sònrachas no èifeachdas.

A. Suidheachadh nam prìomhairean airson gine daonna HIF-1α (NM_181054.2).

B. Cleachd Agilent Brilliant III SYBR Deoch-làidir màthaireil uaine (Cat. Àir. 600882) gus sia nithean deuchainn a mheudachadh.

C. Graf leudachaidh agus lùb leaghaidh air a chlàradh le ionnsramaid CFX qPCR aig Bio-Rad agus primers 3′end.Tha NTCs air an sealltainn ann an dearg.

D. Clàr Cqs de gach nì deuchainn

Mar eisimpleir, tha an toradh ann am P 7 a’ dol an aghaidh riaghailt 3 ′deireadh.Bidh a h-uile dealbhadh gu bunaiteach a’ toirt a-mach na h-aon toraidhean, le dìreach dà mheasgachadh primer a ’leantainn gu leudachadh neo-shònraichte ann an NTC.

Ach, chan urrainn dhuinn taic a thoirt do bhuaidh a’ chriomag GC, oir anns a’ chùis seo, le bhith a’ cleachdadh A no T mar bhunaitean 30 aig a’ char as àirde, chan eil sin a’ lughdachadh sònrachas.

Chlàr Deuchainn C, far a bheil an primer F a’ crìochnachadh ann an GGCC, Cqs ann an NTCn, a’ nochdadh gur dòcha gum biodh duine airson na sreathan sin a sheachnadh aig deireadh 30.Tha sinn a’ daingneachadh gur e an aon dòigh air an t-sreath 3 ′deireadh as fheàrr de phaidhir primer a dhearbhadh a bhith a’ measadh cuid de na tagraichean primers gu deuchainneach.

Èifeachdas leudachaidh

Gu cudromach, ged nach urrainn lorg PCR neo-shònraichte a bhith sònraichte a-riamh, faodar an èifeachdas leudachaidh atharrachadh agus àrdachadh ann an iomadh dòigh le bhith ag atharrachadh an enzyme, deoch-làidir màthaireil, cur-ris, agus suidheachaidhean rothaireachd.

Gus measadh a dhèanamh air èifeachdas lorg PCR, tha e nas fheàrr caolachadh sreathach de 10 no 5 tursan an searbhag niuclasach targaid a chleachdadh, is e sin, an “modh lùb àbhaisteach”.

Ma thèid amplicons PCR no targaidean DNA synthetigeach a chleachdadh gus lùb àbhaisteach a ghineadh, bu chòir lagachadh sreathach de na targaidean sin a mheasgachadh le tomhas cunbhalach de DNA cùl-fhiosrachaidh (leithid DNA genomic).

P8 |Lùb caolachaidh gus èifeachdas PCR a mheasadh.

A. Cleachd primers airson HIF-1: F: AAGAACTTTT CSSGCTCA agus R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC agus Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (àireamh catalog 600882) airson PCR agus suidheachaidhean lùb a leaghadh.

Chaidh B. 100 ng RNA ath-sgrìobhadh air ais, air a lagachadh 2 uair, agus chaidh sampallan cDNA a lagachadh gu sreathach a lagachadh 5 tursan gu 1 ng DNA genomic daonna.Tha an lùb leaghaidh air a shealltainn anns an inset.

C. Chaidh an ath-bhualadh RT, caolachadh, agus caolachadh sreathach ath-aithris airson an dàrna sampall cDNA, agus bha na toraidhean coltach.

Tha P 8 a 'sealltainn dà lùb àbhaisteach, a' cleachdadh an aon dhòigh lorg air dà shampall cDNA eadar-dhealaichte, is e an toradh an aon èifeachdas, timcheall air 100%, agus tha an luach R2 cuideachd coltach, is e sin, an ìre de fhreagarrachd eadar an dàta deuchainneach agus an loidhne ais-tharraing no an dàta Ìre de shreathachd.

Tha an dà lùb àbhaisteach coimeasach, ach chan eil iad dìreach mar an ceudna.Mas e an adhbhar an targaid a thomhas gu ceart, feumar a thoirt fa-near nach eil e iomchaidh àireamhachadh àireamh leth-bhreac a thoirt seachad gun a bhith a’ mìneachadh na mì-chinnt.

P9 |Mì-chinnt tomhais co-cheangailte ri tomhas a’ cleachdadh lùb àbhaisteach.

A. Cleachd primers airson GAPDH (NM_002046) gus PCR agus suidheachaidhean lùb a leaghadh.F: ACAGTTGCCTGTAGACC agus R: TAACTGGTTGAGCACAGG agus bioline's Sensifast SYBR mastermix (àireamh catalog BIO-98050).

B. Clàr leudachaidh, lùb leaghaidh agus lùb àbhaisteach air a chlàradh le ionnsramaid CFX qPCR aig Bio-Rad.

C. Graf lùbte àbhaisteach agus eadar-àm misneachd 95% (CI).

D. An àireamh leth-bhreac agus an eadar-àm misneachd 95% de na trì luachan Cq a thàinig bhon lùb caolachaidh.

Tha P 9 a’ sealltainn, airson deuchainn làn-leasaichte, gu bheil caochlaideachd gnèitheach aon lùb àbhaisteach timcheall air 2 uair (eadar-ama misneachd 95%, aig a’ char as lugha chun a’ char as àirde), agus is dòcha gur e sin an caochlaideachd as lugha ris am bithear a’ dùileachadh.

Bathar co-cheangailte:

Cell Direct RT qPCR Kit

Pasgan PCR dìreach Luchag Tail

Pasgan PCR dìreach feòil bheathaichean