1. Eòlas bunaiteach (ma tha thu airson am pàirt deuchainneach fhaicinn, feuch an gluais thu gu dìreach chun dàrna pàirt)
Mar ath-bhualadh derivative de PCR àbhaisteach, bidh PCR fìor-ùine gu ìre mhòr a’ cumail sùil air atharrachadh na tha de thoradh leudachaidh anns gach cearcall den ath-bhualadh leudachaidh PCR ann an àm fìor tro atharrachadh a’ chomharra fluorescence, agus a’ dèanamh mion-sgrùdadh cainneachdail air an teamplaid tòiseachaidh tron cheangal eadar an luach ct agus an lùb àbhaisteach.
Tha an dàta sònraichte de RT-PCRbun-loidhne, stairsneach fluorescenceagusCt luach.
| bun-loidhne: | Is e luach fluorescence an 3mh-15mh cearcall am bun-loidhne (bun-loidhne), a tha air adhbhrachadh le corra mhearachd tomhais. |
| Cothrom (stairsnich): | A’ toirt iomradh air a’ chrìoch lorg fluorescence a chaidh a shuidheachadh aig suidheachadh iomchaidh ann an roinn fàis eas-chruthach an lùb leudachaidh, sa chumantas 10 tursan nas àirde na claonadh àbhaisteach na bun-loidhne. |
| Luach CT: | Is e seo an àireamh de chuairtean PCR nuair a ruigeas an luach fluorescence anns gach tiùb freagairt an stairsnich. Tha luach Ct ann an co-rèireach ris an ìre de theamplaid tùsail. |
Modhan labeling cumanta airson RT-PCR:
| dòigh-obrach | buannachd | easbhaidh | raon an tagraidh |
| SYBR UaineⅠ | Iomchaidh farsaing, mothachail, saor agus goireasach | Tha riatanasan primer àrd, buailteach do chòmhlain neo-shònraichte | Tha e freagarrach airson mion-sgrùdadh cainneachdail air diofar ghinean targaid, rannsachadh air faireachdainn gine, agus rannsachadh air beathaichean agus lusan ath-chuingealaichte transgenic. |
| TaqMan | Sònrachas math agus ath-aithris àrd | Tha a 'phrìs àrd agus chan eil e freagarrach ach airson amasan sònraichte. | Lorg pathogen, sgrùdadh gine an aghaidh dhrogaichean, measadh èifeachd dhrogaichean, breithneachadh air galairean ginteil. |
| lòchran moileciuil | Sònrachas àrd, fluorescence, cùl-raon ìosal | Tha a 'phrìs àrd, chan eil e freagarrach ach airson adhbhar sònraichte, tha an dealbhadh duilich, agus tha a' phrìs àrd. | Mion-sgrùdadh gine sònraichte, mion-sgrùdadh SNP |
2. Ceumannan deuchainneach
2.1 Mun bhuidheann deuchainneach- feumaidh ioma tobraichean a bhith sa bhuidheann, agus feumaidh ath-aithrisean bith-eòlasach a bhith ann.
| ① | Smachd falamh | Air a chleachdadh gus inbhe fàs cealla a lorg ann an deuchainnean |
| ② | SiRNA smachd àicheil (sreath siRNA neo-shònraichte) | A’ nochdadh sònrachas gnìomh RNAi.Dh’ fhaodadh siRNA freagairt cuideam neo-shònraichte a bhrosnachadh aig dùmhlachd de 200nM. |
| ③ | Transfection Reagent smachd | Na cuir a-mach puinnseanta an ath-ghluasad gluasaid gu na ceallan no a’ bhuaidh air faireachdainn a ’ghine targaid |
| ④ | siRNA an aghaidh gine targaid | Cuir sìos abairt a’ ghine targaid |
| ⑤ (roghainneil) | siRNA adhartach | Air a chleachdadh gus fuasgladh fhaighinn air duilgheadasan siostam deuchainneach agus obrachaidh |
| ⑥ (roghainneil) | SiRNA smachd fluorescent | Faodar èifeachdas tar-chuir cealla fhaicinn le miocroscop |
2.2 Prionnsabalan dealbhadh primer
| Meud pìos leudaichte | Is fheàrr aig 100-150bp |
| Fad Primer | 18-25 lb |
| susbaint GC | 30% -70%, is fheàrr 45% -55% |
| Tm luach | 58-60 ℃ |
| Seicheamh | Seachain T / C leantainneach;A/G leantainneach |
| 3 sreath crìoch | Seachain GC beairteach no AT beairteach;is fheàrr G no C a’ bhunait crìche;Tha e nas fheàrr T a sheachnadh |
| Co-fhreagarrachd | Seachain sreathan co-phàirteach de bharrachd air 3 bhunaitean taobh a-staigh an primer no eadar dà phrìomhaire |
| Sònrachadh | Cleachd sgrùdadh spreadhaidh gus sònrachas primer a dhearbhadh |
Tha ①SiRNA sònraichte do ghnèithean, agus bidh na sreathan de dhiofar ghnèithean eadar-dhealaichte.
Tha ②SiRNA air a phacaigeadh ann am pùdar reòta, a ghabhas a stòradh gu seasmhach airson 2-4 seachdainean aig teòthachd an t-seòmair.
2.3 Innealan no reagents a dh'fheumas a bhith air ullachadh ro-làimh
| Primer (fiosrachadh a-staigh) | A’ toirt a-steach air adhart is air ais dhà |
| Prìomhairean (gine targaid) | A’ toirt a-steach air adhart is air ais dhà |
| Targaid Si RNA (3 stiallan) | San fharsaingeachd, bidh a 'chompanaidh a' co-chur 3 stiallan, agus an uairsin a 'taghadh aon de na trì le RT-PCR |
| Kit Transfection | Lipo2000 msaa. |
| RNA Quick Extraction Kit | Airson às-tharraing RNA às deidh tar-chuir |
| Kit Ath-sgrìobhaidh Rapid Reverse | airson cDNA synthesis |
| Kit Meudachadh PCR | 2 × Super SYBR Uaine qPCR prìomh mheasgachadh |
2.4 A thaobh nan cùisean air am feumar aire a thoirt anns na ceumannan deuchainneach sònraichte:
①siRNA transfection phròiseas
1. Airson plating, faodaidh tu truinnsear 24-tobar, plàta 12-tobar no truinnsear 6-tobar a thaghadh (tha an dùmhlachd RNA cuibheasach a thathar a’ moladh anns gach tobar de phlàta 24-tobar timcheall air 100-300 ng/uL), agus tha an dùmhlachd gluasaid as fheàrr de cheallan suas ri 60% -80% no mar sin
2. Tha na ceumannan tar-chuir agus riatanasan sònraichte gu teann a rèir an stiùiridh.
3. Às deidh tar-chuir, faodar sampallan a chruinneachadh taobh a-staigh 24-72 uairean airson lorg mRNA (RT-PCR) no lorg pròtain taobh a-staigh 48-96 uairean (WB).
② pròiseas às-tharraing RNA
1. Cuir casg air truailleadh le enzyman exogenous.Tha e gu ìre mhòr a’ toirt a-steach caitheamh masgaichean agus mhiotagan gu teann;a 'cleachdadh molaidhean pìobaireachd sterilized agus tiùban EP;feumaidh an t-uisge a thèid a chleachdadh san deuchainn a bhith saor bho RNase.
2. Thathas a 'moladh a bhith a' dèanamh dà uair mar a chaidh a mholadh anns a 'phut tarraing-a-mach luath, a leasaicheas purrachd agus toradh gu mòr.
3. Chan fhaod an leaghan sgudail suathadh ris a’ cholbh RNA.
③ àireamhachadh RNA
Às deidh an RNA a thoirt a-mach, faodar a thomhas gu dìreach le Nanodrop , agus faodaidh an leughadh as ìsle a bhith cho ìosal ri 10ng / ul.
④ Pròiseas tar-sgrìobhaidh air ais
1. Air sgàth cugallachd àrd RT-qPCR, bu chòir co-dhiù 3 tobraichean co-shìnte a dhèanamh airson gach sampall gus casg a chuir air an Ct às deidh sin bho bhith ro eadar-dhealaichte no an SD a bhith ro mhòr airson mion-sgrùdadh staitistigeil.
2. Na reothadh agus a 'leaghadh Master measgachadh a-rithist.
3. Feumar tip ùr a chur an àite gach tiùb/toll!Na cleachd an aon tip pìobaire gu leantainneach gus sampallan a chuir ris!
4. Feumaidh am film a tha ceangailte ris a 'phlàta 96-tobar an dèidh an sampall a chur ris a bhith air a ghlanadh le plàta.Tha e nas fheàrr centrifuge a dhèanamh mus cuir thu air an inneal e, gus an urrainn don leaghan air balla an tiùba sruthadh sìos agus builgeanan èadhair a thoirt air falbh.
⑤ Mion-sgrùdadh lùb cumanta
| Chan eil ùine de dh'fhàs logarithmach ann | Is dòcha dùmhlachd àrd de theamplaid |
| Gun luach CT | Ceumannan ceàrr airson lorg comharran flùraiseach; truailleadh primers no probes - faodar a ionracas a lorg le electrophoresis DUILLEAG; àireamh gu leòr de theamplaid; truailleadh teamplaidean - a 'seachnadh a bhith a' toirt a-steach neo-ionnanachd agus a 'reothadh agus a' leaghadh a-rithist ann an ullachadh sampall; |
| Ct> 38 | Èifeachdas leudachaidh ìosal;Tha toradh PCR ro fhada;tha diofar phàirtean freagairt air an lughdachadh |
| Curve leudachaidh loidhneach | Faodaidh probes a bhith air an lughdachadh gu ìre le cuairtean reòta-loidhnichean no le bhith a’ nochdadh solas fada |
| Tha an eadar-dhealachadh ann an tuill dùblaichte gu sònraichte mòr | Chan eil am fuasgladh freagairt air a leaghadh gu tur no chan eil am fuasgladh freagairt air a mheasgachadh;tha amar teirmeach an ionnstramaid PCR air a thruailleadh le stuthan flùraiseach |
2.5 Mu mhion-sgrùdadh dàta
Faodar mion-sgrùdadh dàta qPCR a roinn ann an tomhas coimeasach agus àireamhachadh iomlan.Mar eisimpleir, ceallan sa bhuidheann làimhseachaidh an coimeas ri ceallan sa bhuidheann smachd,
Cia mheud uair a bhios mRNA an X gine ag atharrachadh, is e tomhas coimeasach a tha seo;ann an àireamh sònraichte de cheallan, mRNA an X gine
Cia mheud lethbhreac a tha ann, is e tomhas iomlan a tha seo.Mar as trice is e an dòigh cainneachdail as motha a bhios sinn a’ cleachdadh san obair-lann.Mar as trice,an dòigh 2-ΔΔctair a chleachdadh as motha ann an deuchainnean , agus mar sin cha tèid ach an dòigh seo a thoirt a-steach gu mionaideach an seo.
Modh 2-ΔΔct: Is e an toradh a gheibhear an eadar-dhealachadh ann an abairt a’ ghine targaid anns a ’bhuidheann deuchainneach an coimeas ris a’ ghine targaid sa bhuidheann smachd.Tha e riatanach gum bi èifeachdas leudachaidh an dà chuid an gine targaid agus an gine iomraidh a-staigh faisg air 100%, agus cha bu chòir don chlaonadh coimeasach a bhith nas àirde na 5%.
Tha an dòigh àireamhachaidh mar a leanas:
Buidheann smachd Δct = luach ct gine targaid ann am buidheann smachd - luach ct gine iomraidh a-staigh sa bhuidheann smachd
Buidheann deuchainneach Δct = luach ct den ghine targaid anns a’ bhuidheann deuchainneach – luach ct den ghine iomraidh a-staigh sa bhuidheann deuchainneach
ΔΔct=buidheann smachd deuchainneach buidheann-Δct
Mu dheireadh, obraich a-mach an iomadachadh eadar-dhealachadh ann an ìre faireachdainn:
Change Fold = 2-ΔΔct (a rèir an gnìomh excel tha POWER)
Bathar co-cheangailte:
Ùine puist: Cèitean-20-2023
