Ⅰ. Meudaich cugallachd an t-siostam freagairt:
1. Separate àrd-inbhe RNA:
Tha synthesis cDNA soirbheachail a’ tighinn bho RNA àrd-inbhe.Bu chòir do RNA àrd-inbhe dèanamh cinnteach gu bheil co-dhiù iomlan nas fhaide agus chan eil bacadh ann anns nach eil enzyman clàraidh, leithid EDTA no SDS.Bidh càileachd RNA a’ dearbhadh an luach as motha den fhiosrachadh sreath as urrainn dhut ath-sgrìobhadh chun cDNA.Tha an dòigh glanaidh RNA coitcheann na dhòigh ceum air a bhith a’ cleachdadh isoocyanate / acidophenol.Gus casg a chuir air truailleadh RNase, feumaidh an RNA a tha air a sgaradh bho shampall a tha beairteach ann an RNase (leithid pancreas) formaldehyde a stòradh gus RNA àrd-inbhe a shàbhaladh, a tha eadhon nas motha airson stòradh fad-ùine.Chaidh an RNA a chaidh a thoirt a-mach às an grùthan radain a dhol sìos gu bunaiteach às deidh seachdain de stòradh ann an uisge, fhad ‘s a bha an RNA a chaidh a thoirt a-mach às an spleen radan fhathast seasmhach às deidh trì bliadhna de stòradh ann an uisge.A bharrachd air an sin, tha tar-sgrìobhaidhean nas motha na 4kb nas mothachaile a bhith a’ lorg truailleadh RNase na tar-sgrìobhaidhean beaga.Gus seasmhachd an sampall RNA stòraidh a mheudachadh, faodar an RNA a sgaoileadh ann am methalmamine ian, agus a stòradh -70 ° C.Chan fhaod nì measgaichte a bhith ann an thylide a thèid a chleachdadh gus RNA a shàbhaladh a tha a’ lughdachadh RNA.Faodar RNA, a thig bho pancreas, a shàbhaladh ann am methalmamine airson co-dhiù bliadhna.Nuair a bhios tu deiseil airson RNA a chleachdadh, faodaidh tu na dòighean a leanas a chleachdadh gus RNA a chuir air falbh: cuir NaCl gu 0.2m agus 4 tursan meud ethanol, cuir teòthachd an t-seòmair airson 3-5 mionaidean, agus 10,000 × g centrifugal airson 5 mionaidean.
2. Cleachd transcriptase cùil às aonais gnìomhachd RNaseH (RNaseH-):
Bidh luchd-bacadh RNase gu tric air an cur ri ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh cùil gus fad agus toradh synthesis cDNA a mheudachadh.Tha inneal-dìon RNase air a chur ris anns a’ chiad ath-bhualadh slabhraidh slabhraidh an làthair bufairean agus riochdairean lughdachadh leithid DTT leis gu bheil am pròiseas synthesis ro-cDNA a’ dì-nàdarachadh an neach-dìon, agus mar sin a’ leigeil ma sgaoil RNases ceangailte a bhios a’ lughdachadh RNA.Bidh neach-dìon pròtain RNase a-mhàin a ’cur casg air truailleadh RNA le RNase A, B, C, agus na cuir casg air RNase air a’ chraiceann, agus mar sin bu chòir a bhith faiceallach gun a bhith a ’toirt a-steach RNAses bho na corragan a dh’ aindeoin cleachdadh nan luchd-dìon sin.
Bidh transcriptase cùil a’ catalachadh tionndadh RNA gu cDNA.Tha gnìomhachd RNaseH endogenous aig an dà chuid M-MLV agus AMV a bharrachd air an gnìomhachd polymerase aca fhèin.Bidh gnìomhachd RNaseH a’ farpais ri gnìomhachd polymerase airson dualan heterozygous a chaidh a chruthachadh eadar teamplaidean RNA agus primers DNA no dualan leudachaidh cDNA, agus a’ lughdachadh RNA: dualan RNA ann an iom-fhilltean DNA.Chan urrainnear teamplaidean RNA air an lughdachadh le gnìomhachd RNaseH a chleachdadh tuilleadh mar fho-stratan èifeachdach airson synthesis cDNA, a’ lughdachadh toradh agus fad synthesis cDNA.Mar sin bhiodh e na bhuannachd mhòr cuir às no lughdachadh mòr air gnìomhachd RNaseH de chùl transcriptase.
Fhuair SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase de RNaseH- agus ath-sgrìobhadh cùl thermoScript, AMV de RNaseH- barrachd cDNA làn-fhaid na MMLV agus AMV.Tha an ìre de cDNA synthesized a’ toirt buaidh air cugallachd RT-PCR.Tha ThermoScript tòrr nas mothachaile na AMV.Tha meud thoraidhean RT-PCR air a chuingealachadh leis a’ chomas a th’ aig transcriptase air ais gus cDNA a cho-chur, gu h-àraidh nuair a thathar a’ clonadh Cdnas nas motha.An coimeas ri MMLV, mheudaich SuperScripⅡ gu mòr an toradh de thoraidhean RT-PCR fada.Bidh transcriptase cùil RNaseH- cuideachd a ’meudachadh seasmhachd teirmeach, agus mar sin faodar an ath-bhualadh a dhèanamh aig teòthachd nas àirde na an àbhaist de 37-42 ℃.Fo na cumhaichean synthesis a chaidh a mholadh, chaidh primers oligo (dT) agus 10μCi [alpha-p] dCTP a chleachdadh.Chaidh cinneasachadh iomlan a’ chiad slabhraidh a thomhas a’ cleachdadh modh sileadh TCA.Chaidh cDNA làn-fhaid a sgrùdadh a’ cleachdadh toirt air falbh stiallan seòrsa meud agus cunntadh ann an gel agarose alcaileach.
3. Meudaich teòthachd gleidheadh teas ath-sgrìobhadh cùil:
Bidh teòthachd cumail nas àirde a 'cuideachadh le bhith a' fosgladh structar àrd-sgoile RNA agus a 'meudachadh toradh an ath-fhreagairt.Airson a ’mhòr-chuid de theamplaidean RNA, le bhith a’ cumail an RNA agus primer aig 65 ° C gun bufair no salann agus an uairsin gan fuarachadh gu sgiobalta air deigh a ’cur às don mhòr-chuid de structaran àrd-sgoile agus a’ leigeil leis na primers ceangal.Ach, tha structar àrd-sgoile fhathast aig cuid de theamplaidean, eadhon às deidh dì-nàdarachadh teirmeach.Faodar leudachadh air na teamplaidean duilich sin a dhèanamh a ’cleachdadh ThermoScript reverse transcriptase agus le bhith a’ cur an ath-bhualadh transcriptase cùil aig teòthachd nas àirde gus leudachadh a leasachadh.Faodaidh teòthachd cumail nas àirde cuideachd sònrachas àrdachadh, gu sònraichte nuair a thèid synthesis cDNA a dhèanamh a’ cleachdadh primers sònraichte gine (GSPS) (faic Caibideil 3).Ma chleachdas tu GSP, dèan cinnteach gu bheil luach Tm a’ phrìomhaire co-ionann ris an teòthachd cumail ris a bheil dùil.Na cleachd oligo (dT) agus primers air thuaiream os cionn 60 ℃.Feumar primers air thuaiream a chumail aig 25 ℃ airson 10 mionaidean mus àrdaich iad gu 60 ℃.A bharrachd air a bhith a’ cleachdadh teodhachd tar-sgrìobhaidh cùil nas àirde, faodar sònrachas a leasachadh le bhith a’ gluasad a’ mheasgachadh RNA/ primer gu dìreach bhon teòthachd dì-nàdurrach 65 ℃ chun an tar-sgrìobhadh cùil a’ cumail teòthachd agus a’ cur measgachadh ath-bhualadh 2 × ro-theasachadh (synthesis tòiseachaidh teirmeach cDNA).Tha an dòigh-obrach seo a’ cuideachadh le bhith a’ cur casg air a’ pharadh bonn eadar-mholacileach a bhios a’ tachairt aig teòthachd nas ìsle.Le bhith a’ cleachdadh ionnstramaid PCR bidh e nas sìmplidhe an iomadh suidse teòthachd a tha riatanach airson RT-PCR.
Bidh polymerase seasmhach Tth teas ag obair mar DNA polymerase an làthair Mg2 + agus RNA polymerase an làthair Mn2 +.Faodaidh e teas a chumail suas gu 65 ℃.Ach, tha làthaireachd Mn2 + rè PCR a’ lughdachadh dìlseachd, a tha a’ fàgail Tth polymerase cho freagarrach airson leudachadh àrd-chinnt, leithid clonadh cDNA.A bharrachd air an sin, chan eil Tth cho èifeachdach ann an tar-sgrìobhadh cùil, a lughdaicheas cugallachd, agus leis gu bheil aon einnsein comasach air tar-sgrìobhadh cùil agus PCR a dhèanamh, chan urrainnear ath-bheachdan smachd às aonais tar-sgrìobhadh cùil a chleachdadh gus toraidhean meudaichte cDNA a dhealachadh bhon fheadhainn aig DNA genomic truaillidh.
4. Cur-ris a bhrosnaicheas tar-sgrìobhadh air ais:
Le bhith a’ cur stuthan cur-ris, a’ gabhail a-steach glycerin agus DMSO, ris a’ chiad fhreagairt synthesis slabhraidh, faodaidh e seasmhachd an dualan dùbailte aig searbhag niuclasach a lughdachadh agus structar àrd-sgoile RNA a thoirt air falbh.Faodar suas ri 20% glycerin no 10% DMSO a chur ris gun a bhith a 'toirt buaidh air gnìomhachd SuperScriptⅡ no MMLV.Faodaidh AMV cuideachd suas ri 20% glycerol fhulang gun a bhith a 'lùghdachadh gnìomhachd.Gus an ìre as motha de chugallachd RT-PCR ann an ath-sgrìobhadh cùl-taic SuperScriptⅡ, faodar glycerol 10% a chur ris agus a chòmhdach aig 45 ℃.Ma thèid 1/10 den toradh ath-sgrìobhaidh ath-sgrìobhadh a chur ris a’ PCR, is e an dùmhlachd de glycerol anns an ath-bhualadh leudachaidh 0.4%, rud nach eil gu leòr airson bacadh a chuir air PCR.
5. RNaseH giollachd:
Faodar cugallachd a leasachadh le bhith a’ làimhseachadh ath-bheachdan synthesis cDNA le RNaseH ro PCR.Airson cuid de theamplaidean, thathas den bheachd gu bheil an RNA anns an ath-bhualadh cDNA synthesis a ’cur casg air ceangal thoraidhean leudaichte, agus sa chùis sin faodaidh làimhseachadh RNaseH cugallachd àrdachadh.San fharsaingeachd, tha feum air làimhseachadh RNaseH airson leudachadh air teamplaid targaid cDNA làn-fhad a tha an ìre mhath fada, leithid scherosis tuberousⅡ le leth-bhreac ìosal.Airson an teamplaid dhoirbh seo, leasaich RNaseH an comharra a chaidh a chruthachadh leis an cDNA air a cho-chur le SuperScriptⅡ no AMV.Airson a’ mhòr-chuid de ath-bheachdan RT-PCR, tha làimhseachadh RNaseH roghainneil leis gu bheil an ceum dì-nàdurachaidh PCR inslithe 95 ℃ mar as trice a’ uisgeachadh an RNA bhon RNA: iom-fhillte DNA.
6. Modhan nas fheàrr airson a bhith a' lorg meudan beaga de RNA:
Tha RT-PCR gu sònraichte dùbhlanach nuair nach eil ach glè bheag de RNA ri fhaighinn.Le bhith a’ cur glycogen a-steach mar neach-giùlan rè dealachadh RNA a’ cuideachadh le bhith ag àrdachadh toradh sampallan beaga.Faodar glycogen gun RNase a chur ris aig an aon àm ri Trizol.Tha glycogen soluiteach ann an uisge agus faodaidh e fuireach anns an ìre uisge le RNA gus cuideachadh le sileadh às deidh sin.Is e an dùmhlachd a thathar a’ moladh de glycogen gun RNase 250μg/ml airson sampallan nas lugha na 50mg de maothran no 106 ceallan cultarach.
Le bhith a’ cur BSA acetylated a-steach gus ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh a thionndadh air ais le bhith a’ cleachdadh SuperScriptⅡ faodaidh sin an cugallachd àrdachadh, agus airson suimean beaga de RNA, le bhith a’ lughdachadh na tha de SuperScriptⅡ agus a’ cur 40 aonad de RnaseOut nuclease inhibitor faodaidh e an ìre lorgaidh a leasachadh.Ma thèid glycogen a chleachdadh ann an dealachadh RNA, thathas fhathast a’ moladh cuir a-steach luchd-bacadh BSA no RNase gus ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh a thionndadh air ais a’ cleachdadh SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Meudaich sònrachas RT-PCR
1. cNDA synthesis:
Faodar trì dòighean eadar-dhealaichte a chleachdadh gus synthesis cDNA a’ chiad dualan a thòiseachadh, agus tha sònrachas coimeasach gach dòigh a’ toirt buaidh air meud agus seòrsa cDNA synthesized.
Is e modh Random primer an ìre as sònraichte de na trì dòighean.Bithear a’ comharrachadh primers aig grunn làraich air feadh an tar-sgrìobhaidh gus cDNA goirid, pàirt-ùine a thoirt gu buil.Tha an dòigh seo gu tric air a chleachdadh gus sreathan crìochnachaidh 5 ′ agus cDNA fhaighinn bho theamplaidean RNA le roinnean structarail àrd-sgoile no le làraich crìochnachaidh nach urrainn ath-riochdachadh a dhèanamh air transcriptase.Gus an cDNA as fhaide fhaighinn, feumar an co-mheas de primers gu RNA anns gach sampall RNA a dhearbhadh gu empirigeach.Tha a’ chiad chruinneachadh de primers air thuaiream a’ dol bho 50 gu 250ng gach siostam freagairt 20μl.Leis gu bheil an cDNA air a cho-chur bho RNA iomlan a’ cleachdadh primers air thuaiream gu ìre mhòr mar RNA ribosomal, tha poly(A) + RNA mar as trice air a thaghadh mar an teamplaid.
Tha tòiseachadh Oligo (dT) nas mionaidiche na primers air thuaiream.Bidh e ag eadar-cheangal leis an earball poly(A) a lorgar aig ceann 3 ′ mRNA anns a’ mhòr-chuid de cheallan eukaryotic.Leis gu bheil poly(A) + RNA timcheall air 1% gu 2% den RNA iomlan, tha meud agus iom-fhillteachd cDNA mòran nas lugha na bhiodh iad nan cleachdadh air thuaiream primers.Air sgàth cho sònraichte ‘s a tha e, mar as trice chan fheum oligo (dT) optimization airson co-mheas RNA gu primer agus taghadh poly(A) +.Thathas a’ moladh 0.5μg oligo(dT) a chleachdadh gach siostam freagairt 20μl.Tha oligo (dT) 12-18 freagarrach airson a’ mhòr-chuid de RT-PCR.Tha Siostam ThermoScript RT-PCR a’ toirt seachad oligo (dT) 20 air sgàth cho math sa tha e seasmhachd teirmeach agus tha e freagarrach airson teòthachd cumail nas àirde.
Is e primers gine-sònraichte (GSP) na prìomhairean sònraichte as fheàrr airson a’ cheum tar-sgrìobhaidh cùil.Is e oligonucleoside antisense a th’ ann an GSP a dh’ fhaodas tar-chur gu sònraichte le sreathan ceann-uidhe RNA, an àite a bhith a’ cuir a-steach a h-uile Rnas mar primers air thuaiream no oligo (dT).Tha na riaghailtean a thathas a’ cleachdadh airson primers PCR a dhealbhadh cuideachd a’ buntainn ri dealbhadh freagairt ath-sgrìobhaidh cùil GSP.Faodaidh GSP a bhith san aon sreath ris an primer leudachaidh a chaidh ainmeachadh aig deireadh mRNA3′, no faodar GSP a dhealbhadh gus a bhith air a chuir sìos an abhainn leis a’ phrìomhaire leudachaidh cùil.Airson cuid de nithean leudaichte, feumar barrachd air aon primer antisensense a dhealbhadh airson RT-PCR soirbheachail oir dh’ fhaodadh structar àrd-sgoile an RNA targaid casg a chuir air a ’phrìomhaire bho cheangal.Thathas a’ moladh 1pmol antisense GSP a chleachdadh anns a’ chiad siostam freagairt synthesis slabhraidh de 20μl.
2. Meudaich teòthachd gleidheadh teas ath-sgrìobhadh cùil:
Gus làn bhuannachd a ghabhail de shònrachas GSP, bu chòir transcriptase cùil le seasmhachd teirmeach àrd a chleachdadh.Faodar transcriptase cùil seasmhach le teas a chòmhdach aig teòthachd nas àirde gus cruas ath-bhualadh àrdachadh.Mar eisimpleir, ma thèid GSP a chuir an cèill aig 55 ° C, chan eilear a’ cleachdadh sònrachas GSP gu h-iomlan ma thèid tar-sgrìobhadh cùil a dhèanamh aig 37 ° C le cruas ìosal a’ cleachdadh AMV no M-MLV.Ach, faodaidh SuperScripⅡ agus ThermoScript freagairt aig 50 ℃ no nas àirde, a chuireas às do thoraidhean neo-shònraichte air an dèanamh aig teòthachd nas ìsle.Airson an sònrachas as àirde, faodar am measgachadh RNA / primer a ghluasad gu dìreach bhon teòthachd dì-nàdurrach 65 ℃ chun an tar-sgrìobhadh cùil a ’cumail teòthachd le bhith a’ cur a-steach measgachadh ath-bhualadh 2 x ro-theasachadh (tòiseachadh teirmeach de cDNA synthesis).Bidh seo a’ cuideachadh le casg a chuir air co-chaidreachas bunaiteach eadar moileciuilean aig teòthachd ìosal.Le bhith a’ cleachdadh ionnstramaid PCR bidh e nas sìmplidhe an iomadh eadar-ghluasad teòthachd a tha riatanach airson RT-PCR.
3. Lùghdaich truailleadh DNA genomic:
Is e aon duilgheadas a dh’ fhaodadh a bhith ann le RT-PCR gu bheil RNA a’ truailleadh DNA genomic.Tha cleachdadh dhòighean dealachaidh RNA nas fheàrr, leithid Trizol Reagent, a’ lughdachadh truailleadh DNA genomic ann an ullachadh RNA.Gus toraidhean bho DNA genomic a sheachnadh, faodar an RNA a làimhseachadh le ìre leudachaidh DnasⅠ gus DNA truaillidh a thoirt air falbh mus tèid ath-sgrìobhadh air ais.Chaidh na sampallan a chumail aig 65 ℃ ann an EDTA 2.0mM airson 10 mionaidean gus crìoch a chuir air cnàmhadh DNaseⅠ.Bidh EDTA a’ chelates ions magnesium gus casg a chuir air hydrolysis RNA a tha an urra ri ionan magnesium a bhios a’ tachairt aig teòthachd àrd.
Gus cDNA leudaichte a sgaradh bhon toradh leudachaidh genome DNA, faodar primers a bhios a ’ceangal air leth leis an exon sgaraichte a dhealbhadh.Bidh toraidhean PCR a thig bho cDNA nas giorra na an fheadhainn a thig bho DNA genomic truaillidh.Bithear cuideachd a’ dèanamh deuchainn fo smachd gun tar-sgrìobhadh air ais air gach teamplaid RNA gus faighinn a-mach a bheil criomag sònraichte bho DNA genomic no cDNA.Tha toraidhean PCR a gheibhear às aonais tar-sgrìobhadh cùil a’ tighinn bhon genoma.
Bathar Co-cheangailte
RT-PCR furastaaidhI (Aon Cheum)
-Tha an uidheamachd aon-cheum a’ comasachadh tar-sgrìobhadh cùil agus PCR a dhèanamh san aon phìob.Chan fheum e ach teamplaid RNA a chuir ris, primers PCR sònraichte agus ddH gun RNase2O.
-Faodar mion-sgrùdadh cainneachdail fìor-ùine air RNA a dhèanamh gu sgiobalta agus gu ceart.
-Tha an cromag a’ cleachdadh inneal ath-sgrìobhaidh cùil Foregene gun samhail agus Foregene HotStar Taq DNA Polymerase còmhla ri siostam freagairt gun samhail gus èifeachdas leudachaidh agus sònrachas an ath-bhualadh adhartachadh gu h-èifeachdach.
-Tha an siostam ath-bhualadh làn-leasaichte a’ toirt air an ath-bhualadh mothachadh lorgaidh nas àirde, seasmhachd teirmeach nas làidire, agus fulangas nas fheàrr.
-Comas èifeachdach air gDNA a thoirt air falbh, a bheir air falbh gDNA san teamplaid taobh a-staigh 2 mhionaid.
- Siostam tar-sgrìobhaidh cùil èifeachdach, cha toir e ach 15 mionaidean gus synthesis a’ chiad dual cDNA a chrìochnachadh.
-Teamplaidean iom-fhillte: faodar teamplaidean le susbaint àrd GC agus structar àrd-sgoile iom-fhillte a thionndadh air ais le àrd èifeachdas.
-Siostam tar-sgrìobhaidh cùil àrd-chugallachd, faodaidh teamplaidean ìre pg cDNA àrd-inbhe fhaighinn cuideachd.
-Tha seasmhachd teirmeach àrd aig an t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil, is e an teòthachd ath-bhualadh as fheàrr 42 ℃, agus tha coileanadh tar-sgrìobhaidh math aige fhathast aig 50 ℃.
Ùine puist: Mar-07-2023
