一 、 Meudaich cugallachd an t-siostam freagairt:

1. Iomallach àrd-inbhe RNA:

Tha synthesis cDNA soirbheachail a’ tighinn bho RNA de chàileachd àrd.Bu chòir RNA àrd-inbhe a bhith co-dhiù làn-fhaid agus saor bho luchd-bacadh transcriptase cùil leithid EDTA no SDS.Bidh càileachd RNA a’ dearbhadh an ìre as motha de dh’fhiosrachadh sreath as urrainn dhut ath-sgrìobhadh gu cDNA.Tha dòigh glanaidh RNA cumanta na dhòigh aon-cheum a’ cleachdadh guanidine isothiocyanate / acid phenol.Gus casg a chuir air truailleadh le meudan lorg de RNase, feumar RNA a tha dealaichte bho shamhlaichean beairteach RNase (leithid pancreas) a stòradh ann am formaldehyde gus RNA àrd-inbhe a ghleidheadh, gu sònraichte airson stòradh fad-ùine.Chaidh an RNA a chaidh a thoirt a-mach à grùthan radain a mhilleadh gu bunaiteach às deidh dha a bhith air a stòradh ann an uisge airson seachdain, fhad ‘s a bha an RNA a chaidh a thoirt a-mach à spleen radan fhathast seasmhach às deidh dha a bhith air a stòradh ann an uisge airson 3 bliadhna.A bharrachd air an sin, tha tar-sgrìobhaidhean nas fhaide na 4 kb nas mothachail air truailleadh le lorg RNases na tar-sgrìobhaidhean beaga.Gus seasmhachd sampallan RNA a tha air an stòradh a mheudachadh, faodar RNA a sgaoileadh ann am formamide deionized agus a stòradh aig -70 ° C.Feumaidh formamide a thathar a 'cleachdadh airson RNA a ghleidheadh ​​​​a bhith saor bho sprùilleach a tha a' lùghdachadh RNA.Faodar RNA bhon pancreas a ghleidheadh ​​​​ann an formamide airson co-dhiù bliadhna.Nuair a bhios tu ag ullachadh airson RNA a chleachdadh, faodaidh tu an dòigh a leanas a chleachdadh gus RNA a chuir air falbh: cuir NaCl ri 0.2M agus 4 tursan meud ethanol, cuir aig teòthachd an t-seòmair airson 3-5 mionaidean, agus centrifuge aig 10,000 × g airson 5 mionaidean.

2. Cleachd an tar-sgrìobhadh cùl RNaseH-inactive (RNaseH-):

Bidh luchd-bacadh RNase gu tric air an cur ri ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh cùil gus fad agus toradh synthesis cDNA a mheudachadh.Bu chòir luchd-dìon RNase a bhith air an cur ris rè ath-bhualadh synthesis ciad-snàithle an làthair bufair agus àidseant lughdachaidh (leithid DTT), leis gu bheil am pròiseas ro cDNA synthesis a’ dì-nàdarachadh an neach-dìon, agus mar sin a ’leigeil a-mach RNase ceangailte a dh’ fhaodas RNA a lughdachadh.Bidh luchd-dìon pròtain RNase a-mhàin a’ cur casg air truailleadh RNA le RNase A, B, C, agus na cuir casg air RNase air a’ chraiceann, mar sin bi faiceallach gun a bhith a’ toirt a-steach RNase bho do chorragan a dh’ aindeoin cleachdadh nan luchd-dìon sin.

Bidh transcriptase cùil a’ catalachadh tionndadh RNA gu cDNA.Tha gnìomhachd RNaseH endogenous aig an dà chuid M-MLV agus AMV a bharrachd air an gnìomhachd polymerase aca fhèin.Bidh gnìomhachd RNaseH agus gnìomhachd polymerase a’ farpais ri chèile airson an dual tar-chinealach a chaidh a chruthachadh eadar an teamplaid RNA agus an DNA primer no dualan leudachaidh cDNA, agus a’ lughdachadh an dualan RNA anns an ionad RNA: DNA.Chan urrainn don teamplaid RNA a tha air a lughdachadh le gnìomhachd RNaseH a bhith na fho-strat èifeachdach airson synthesis cDNA, a lughdaicheas toradh agus fad synthesis cDNA.Mar sin, bhiodh e buannachdail cuir às no lughdachadh mòr air gnìomhachd RNaseH de chùl-sgrìobhadh transcriptase..

Faodaidh SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase agus thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, barrachd meud agus barrachd cDNA làn-fhaid fhaighinn na MMLV agus AMV.Bidh buaidh aig an ìre de synthesis cDNA air cugallachd RT-PCR.Tha ThermoScript tòrr nas mothachaile na AMV.Tha meud thoraidhean RT-PCR air a chuingealachadh leis a’ chomas a th’ aig transcriptase air ais gus cDNA a cho-chur, gu sònraichte nuair a bhios iad a’ clonadh cDNAn nas motha.An coimeas ri MMLV, mheudaich SuperScripⅡ gu mòr an toradh de thoraidhean RT-PCR fada.Tha an transcriptase RNaseH-reverse cuideachd air teirm-sheasmhachd àrdachadh, agus mar sin faodar an ath-bhualadh a dhèanamh aig teòthachd nas àirde na an àbhaist 37-42 ° C.Fo na cumhaichean synthesis a chaidh a mholadh, cleachd primer oligo (dT) agus 10 μCi de [α-P] dCTP.Chaidh toradh iomlan a’ chiad dualan a thomhas a’ cleachdadh modh sileadh TCA.Chaidh cDNA làn-fhaid a sgrùdadh le bhith a’ cleachdadh bannan seòrsa meud air an cuir às agus air an cunntadh air gel agarose alcalin.

3. Àrdaich an teòthachd goir airson ath-sgrìobhadh air ais:

Bidh teòthachd brosnachaidh nas àirde a 'cuideachadh le bhith a' fosgladh structar àrd-sgoile RNA, a 'meudachadh toradh an ath-fhreagairt.Airson a ’mhòr-chuid de theamplaidean RNA, le bhith a’ toirt a-steach an RNA agus primers aig 65 ° C gun bufair no salann, agus an uairsin fuarachadh luath air deigh cuir às don mhòr-chuid de structaran àrd-sgoile agus leigidh sin le primers ceangal.Ach, tha structaran àrd-sgoile fhathast aig cuid de theamplaidean, eadhon às deidh dì-ghalarachadh teas.Faodar leudachadh air na teamplaidean duilich sin a dhèanamh le bhith a ’cleachdadh ThermoScript Reverse Transcriptase agus a’ cur an ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh cùil aig teòthachd nas àirde gus leudachadh a leasachadh.Faodaidh teòthachd àrdachaidh nas àirde cuideachd sònrachas àrdachadh, gu h-àraidh nuair a thathar a’ cleachdadh primers gine-sònraichte (GSP) airson synthesis cDNA (faic Caibideil 3).Ma chleachdas tu GSP, dèan cinnteach gu bheil Tm nan primers an aon rud ris an teòthachd brosnachaidh ris a bheil dùil.Na cleachd oligo (dT) agus primers air thuaiream os cionn 60 ° C.Feumaidh primers air thuaiream goir aig 25 ° C airson 10 mionaidean mus àrdaich iad gu 60 ° C.A bharrachd air a bhith a’ cleachdadh teòthachd tar-sgrìobhaidh cùil nas àirde, faodar sònrachas a leasachadh cuideachd le bhith a’ gluasad a’ mheasgachadh RNA/primer gu dìreach bhon teòthachd dì-nàdurachaidh 65 ° C gu teòthachd brosnachaidh tar-sgrìobhaidh cùil agus a’ cur measgachadh ath-bhualadh 2 × ro-bhlàthachadh (cDNA hot-start synthesis).Tha an dòigh-obrach seo a’ cuideachadh le bhith a’ cur casg air a’ pharadh bonn eadar-mholacileach a bhios a’ tachairt aig teòthachd nas ìsle.Faodar an tionndadh ioma-teòthachd a tha a dhìth airson RT-PCR a dhèanamh nas sìmplidhe le bhith a’ cleachdadh cearcall teirmeach.

Bidh Tth thermostable polymerase ag obair mar DNA polymerase an làthair Mg2 + agus mar RNA polymerase an làthair Mn2 +.Faodar a chumail blàth aig teòthachd as àirde de 65 ° C.Ach, tha làthaireachd Mn2 + rè PCR a’ lughdachadh dìlseachd, a tha a’ fàgail Tth polymerase cho freagarrach airson leudachadh àrd-chruinneas, leithid clonadh cDNA.A bharrachd air an sin, tha èifeachdas tar-sgrìobhaidh cùil ìosal aig Tth, a lughdaicheas cugallachd, agus, leis gum faodar tar-sgrìobhadh cùil agus PCR a dhèanamh le aon enzym, chan urrainnear ath-bheachdan smachd às aonais tar-sgrìobhadh cùil a chleachdadh gus coimeas a dhèanamh eadar toraidhean leudachaidh cDNA le DNA genomic truailleadh.Chaidh na toraidhean leudachaidh a sgaradh.

4. Cur-ris a bhrosnaicheas tar-sgrìobhadh air ais:

Bithear a’ cur stuthan cur-ris a’ toirt a-steach glycerol agus DMSO ris an ath-bhualadh synthesis ciad-snàithle, a dh’ fhaodadh seasmhachd an dual-dùbailte searbhag niuclasach a lughdachadh agus structar àrd-sgoile RNA fhuasgladh.Faodar suas ri 20% glycerol no 10% DMSO a chur ris gun a bhith a 'toirt buaidh air gnìomhachd SuperScript II no MMLV.Faodaidh AMV cuideachd suas ri 20% glycerol fhulang gun call gnìomhachd.Gus an ìre as motha de chugallachd RT-PCR a mheudachadh anns an ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh cùil SuperScriptⅡ, faodar glycerol 10% a chur ris agus a bhrosnachadh aig 45 ° C.Ma thèid 1/10 den toradh ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh cùil a chur ri PCR, is e an dùmhlachd de glycerol anns an ath-bhualadh leudachaidh 0.4%, rud nach eil gu leòr airson bacadh a chuir air PCR.

5. RNaseH treat:

Faodaidh làimhseachadh ath-bheachdan synthesis cDNA le RNaseH ro PCR cugallachd àrdachadh.Airson cuid de theamplaidean, thathas den bheachd gu bheil RNA anns an ath-bhualadh cDNA synthesis a’ cur casg air ceangal stuthan leudachaidh, agus mar sin faodaidh làimhseachadh RNaseH cugallachd àrdachadh.San fharsaingeachd, tha feum air làimhseachadh RNaseH nuair a thathar ag àrdachadh teamplaidean targaid cDNA làn-fhad nas fhaide, leithid scherosis tuberous le leth-bhreac II.Airson an teamplaid dhoirbh seo, leasaich làimhseachadh RNaseH an comharra a chaidh a thoirt a-mach le SuperScript II no cDNA co-shìnte AMV.Airson a’ mhòr-chuid de ath-bheachdan RT-PCR, tha làimhseachadh RNaseH roghainneil, leis gu bheil an ceum dì-nàdurachaidh PCR aig 95 ° C mar as trice a’ uisgeachadh an RNA anns an ionad RNA: DNA.

6. Leasachadh modh lorgaidh RNA beag:

Tha RT-PCR gu sònraichte dùbhlanach nuair nach eil ach glè bheag de RNA ri fhaighinn.Bidh glycogen air a chur ris mar neach-giùlan rè aonaranachd RNA a’ cuideachadh le bhith ag àrdachadh toradh sampallan beaga.Faodar glycogen gun RNase a chur ris aig an aon àm ri Trizol a chur ris.Tha glycogen so-sgaoilte ann an uisge agus faodar a chumail anns an ìre uisgeach le RNA gus cuideachadh le sileadh às deidh sin.Airson sampallan nas lugha na 50 mg de stuth clò no 106 ceallan cultarach, is e an dùmhlachd de glycogen gun RNase 250 μg / ml.

Le bhith a’ cur BSA acetylated ris an ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh cùil le bhith a’ cleachdadh SuperScript II faodaidh sin an cugallachd àrdachadh, agus airson meudan beaga de RNA, le bhith a’ lughdachadh na tha de SuperScript II agus a’ cur 40 aonad de RNaseOut nuclease inhibitor faodaidh an ìre lorgaidh àrdachadh.Ma thèid glycogen a chleachdadh ann am pròiseas iomallachd RNA, thathar fhathast a 'moladh BSA no RNase inhibitor a chur ris nuair a bhios tu a' cleachdadh SuperScript II airson ath-sgrìobhadh tar-sgrìobhaidh air ais.

, 、 Meudaich sònrachas RT-PCR

1. CND Asynthesis:

Faodar synthesis cDNA den chiad ìre a thòiseachadh le bhith a’ cleachdadh trì dòighean eadar-dhealaichte, agus tha an sònrachas coimeasach a’ toirt buaidh air meud agus seòrsa cDNA synthesized.

B’ e am modh primer air thuaiream an ìre as sònraichte de na trì dòighean.Bidh prìomhairean a’ nochdadh aig grunn làraich air feadh an tar-sgrìobhaidh, a’ gineadh cDNAn goirid, pàirt-ùine.Tha an dòigh seo air a chleachdadh gu tric gus sreathan crìochnachaidh 5 ′ fhaighinn agus gus cDNA fhaighinn bho theamplaidean RNA le roinnean de structar àrd-sgoile no le làraich crìochnachaidh nach gabh ath-riochdachadh le transcriptase cùil.Gus an cDNA as fhaide fhaighinn, feumar an co-mheas de primers gu RNA anns gach sampall RNA a dhearbhadh gu empirigeach.Bha an ìre tòiseachaidh de primers air thuaiream eadar 50 agus 250 ng gach freagairt 20 μl.Leis gur e RNA ribosomal a th’ ann an cDNA air a cho-chur bho RNA iomlan a’ cleachdadh primers air thuaiream, mar as trice tha poly(A) + RNA air a thaghadh mar an teamplaid.

Tha primers Oligo (dT) nas mionaidiche na primers air thuaiream.Bidh e ag eadar-cheangal ris an earball poly(A) a lorgar aig deireadh 3 ′ den mhòr-chuid de mRNAn eukaryotic.Leis gu bheil poly(A)+ RNA timcheall air 1% gu 2% den RNA iomlan, tha meud agus iom-fhillteachd cDNA mòran nas lugha na le primers air thuaiream.Air sgàth cho sònraichte ‘s a tha e, mar as trice chan fheum oligo (dT) an co-mheas de RNA gu primers agus taghadh poly(A) + a mheudachadh.Thathas a’ moladh 0.5μg oligo(dT) a chleachdadh gach siostam freagairt 20μl.Tha oligo (dT) 12-18 freagarrach airson a’ mhòr-chuid de RT-PCR.Tha an Siostam ThermoScript RT-PCR a’ tabhann oligo (dT) 20 air sgàth cho seasmhach ‘s a tha e teirmeach airson teòthachd guir nas àirde.

Is e primers gine sònraichte (GSP) na prìomhairean as sònraichte airson a’ cheum tar-sgrìobhaidh cùil.Is e oligonucleotide antisense a th’ ann an GSP a dh’ fhaodas tar-chur gu sònraichte ris an t-sreath targaid RNA, eu-coltach ri primers air thuaiream no oligo (dT), a bhios a’ ceangal ris a h-uile RNA.Tha na h-aon riaghailtean a thathas a’ cleachdadh airson primers PCR a dhealbhadh a’ buntainn ri dealbhadh GSP ann an ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh cùil.Faodaidh an GSP a bhith san aon sreath ris a’ phrìomhaire leudachaidh a tha a’ ceangal ris a’ cheann 3 ′-as motha den mRNA, no faodar an GSP a dhealbhadh gus a dhol sìos an abhainn bhon primer leudachaidh cùil.Airson cuid de chuspairean leudaichte, feumar barrachd air aon primer antisense a dhealbhadh airson RT-PCR soirbheachail oir dh’ fhaodadh structar àrd-sgoile an RNA targaid casg a chuir air ceangal primer.Thathas a’ moladh 1 pmol antisense GSP a chleachdadh ann am freagairt synthesis ciad-shreath 20 μl.

2. Àrdaich an teòthachd goir airson ath-sgrìobhadh air ais:

Gus làn bhuannachd a ghabhail de shònrachas GSP, bu chòir transcriptase cùil le teirm-sheasmhachd nas àirde a chleachdadh.Faodar tar-sgrìobhaidhean cùil teirmeastat a ghluasad aig teòthachd nas àirde gus teannachadh ath-bhualadh àrdachadh.Mar eisimpleir, ma dh’ ainmicheas GSP aig 55 ° C, cha tèid sònrachas an GSP a chleachdadh gu h-iomlan ma thèid AMV no M-MLV a chleachdadh airson tar-sgrìobhadh air ais aig teann ìosal de 37 ° C.Ach, faodar dèiligeadh ri SuperScript II agus ThermoScript aig 50 ° C no nas àirde, a chuireas às do thoraidhean neo-shònraichte air an gineadh aig teòthachd nas ìsle.Airson an sònrachas as motha, faodar am measgachadh RNA / primer a ghluasad gu dìreach bhon teòthachd dì-nàdurrach 65 ° C gu teòthachd brosnachaidh tar-sgrìobhaidh cùil agus a chuir ri measgachadh ath-bhualadh 2 × ro-bhlàthachadh (tòiseachadh teth synthesis cDNA).Bidh seo a’ cuideachadh le bhith a’ cur casg air a bhith a’ càradh bun-stèidh eadar-mholacileach aig teòthachd ìosal.Faodar na h-eadar-ghluasadan ioma-teòthachd a tha a dhìth airson RT-PCR a dhèanamh nas sìmplidhe le bhith a’ cleachdadh cearcall teirmeach.

3. A 'lùghdachadh truailleadh DNA genomic:

Is e duilgheadas a dh’ fhaodadh tachairt le RT-PCR truailleadh DNA genomic anns an RNA.Le bhith a’ cleachdadh deagh dhòigh aonaranachd RNA, leithid Trizol Reagent, lughdaichidh sin na tha de DNA genomic a’ truailleadh ullachadh RNA.Gus toraidhean a thig bho DNA genomic a sheachnadh, faodar RNA a làimhseachadh le ìre leudachaidh DNase I gus DNA truaillidh a thoirt air falbh mus tèid ath-sgrìobhadh air ais.Chaidh crìoch a chuir air cnàmhadh DNase I le bhith a’ toirt a-steach na sampallan ann an EDTA 2.0 mM airson 10 mionaidean aig 65 ° C.Faodaidh EDTA ions magnesium a chealadh, a’ cur casg air hydrolysis RNA a tha an urra ri ionan magnesium aig teòthachd àrd.

Gus cDNA leudaichte a sgaradh bho bhith a’ truailleadh thoraidhean leudachaidh DNA genomic, faodar primers a dhealbhadh a bhios gach anneal gus exons a sgaradh.Bidh toraidhean PCR a thig bho cDNA nas giorra na an fheadhainn a thig bho DNA genomic truaillidh.A bharrachd air an sin, chaidh deuchainn smachd gun ath-sgrìobhadh cùil a dhèanamh air gach teamplaid RNA gus faighinn a-mach an tàinig criomag sònraichte bho DNA genomic no cDNA.Tha an toradh PCR a gheibhear às aonais tar-sgrìobhadh cùil a’ tighinn bhon genoma.