Tha RT-qPCR air a leasachadh bho theicneòlas PCR àbhaisteach.Bidh e a’ cur ceimigean flùraiseach (dathan flùraiseach no probes fluorescent) ris an t-siostam ath-bhualadh PCR traidiseanta, agus a’ lorg pròiseas annealing agus leudachaidh PCR ann an àm fìor a rèir an diofar uidheamachd luminescent.Bithear a’ cleachdadh atharrachaidhean comharran flùraiseach sa mheadhan gus obrachadh a-mach na tha de dh’ atharrachadh toraidh anns gach cearcall de PCR.An-dràsta, is e na dòighean as cumanta dòigh dath fluorescent agus modh sgrùdaidh.

Modh dath flùraiseach:
Chan eil cuid de dhhathan flùraiseach, leithid SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, msaa, a’ leigeil a-mach solas leotha fhèin, ach a’ leigeil a-mach fluorescence às deidh dhaibh a bhith ceangailte ris an groove bheag de dsDNA.Mar sin, aig toiseach an ath-bhualadh PCR, chan urrainn don inneal an comharra flùraiseach a lorg.Nuair a thèid an ath-bhualadh air adhart gu leudachadh annealing (dòigh dà-cheum) no ìre leudachaidh (modh trì-cheum), tha na dualan dùbailte air am fosgladh aig an àm seo, agus an DNA polymerase ùr Rè synthesis dualan, bidh moileciuilean flùraiseach air an cur còmhla anns an dsDNA beag groove agus a’ leigeil a-mach fluorescence.Mar a bhios an àireamh de chuairtean PCR a’ dol am meud, bidh barrachd is barrachd dhathan a’ tighinn còmhla ri dsDNA, agus tha an comharra flùraiseach cuideachd air àrdachadh gu leantainneach.Gabh SYBR Green Ⅰ mar eisimpleir.
Modh sgrùdaidh:
Is e probe Taqman an probe hydrolysis as cumanta.Tha buidheann flùraiseach aig deireadh 5 ′ den probe, mar as trice FAM.Tha an probe fhèin na shreath a tha co-phàirteach ris a’ ghine targaid.Tha buidheann quenching fluorescent aig ceann 3 ′ den fluorophore.A rèir prionnsapal gluasad lùth ath-shuidheachadh fluorescence (gluasad lùth ath-shuidheachadh Förster, FRET), nuair a bhios am buidheann fluorescent neach-aithris (moileciuil fluorescent tabhartaiche) agus a ’bhuidheann fluorescent quenching (gabhail ri moileciuil fluorescent) Nuair a bhios an speactram excitation a’ dol thairis air agus tha an astar glè dhlùth (7-10nm), faodaidh an neach-aithris fluorescent moileciuil a bhith a ’gabhail ris a’ mholacail fluorescent fèin-ghluasadach. air a lagachadh.Mar sin, aig toiseach an ath-bhualadh PCR, nuair a tha an probe an-asgaidh agus slàn san t-siostam, cha bhith a’ bhuidheann fluorescent neach-aithris a ’leigeil a-mach fluorescence.Nuair a bhios tu a’ annealadh, bidh am primer agus an probe a’ ceangal ris an teamplaid.Aig ìre an leudachaidh, bidh am polymerase an-còmhnaidh a’ co-chur slabhraidhean ùra.Tha gnìomhachd exonuclease 5′-3′ aig DNA polymerase.Nuair a ruigeas e an probe, bidh an DNA polymerase a’ uisgeachadh an probe bhon teamplaid, a’ dealachadh buidheann flùraiseach an neach-aithris bhon bhuidheann fluorescent quencher, agus a’ leigeil ma sgaoil an comharra flùraiseach.Leis gu bheil dàimh aon-ri-aon eadar an probe agus an teamplaid, tha an dòigh sgrùdaidh nas fheàrr na an dòigh dath a thaobh cruinneas agus cugallachd an deuchainn.

Fig 1 Prionnsabal qRT-PCR

Dealbhadh primer
Prionnsabalan:

Bu chòir na primers a dhealbhadh anns an roinn glèidhte den t-sreath searbhag niuclasach agus bu chòir dhaibh a bhith sònraichte.

Tha e nas fheàrr sreath cDNA a chleachdadh, agus tha òrdugh mRNA iomchaidh cuideachd.Mura h-eil, faigh a-mach dealbhadh sgìre cds den t-sreath DNA.
Is e fad an toraidh cainneachdail fluorescent 80-150bp, is e an tè as fhaide 300bp, tha fad an primer sa chumantas eadar bunaitean 17-25, agus cha bu chòir an eadar-dhealachadh eadar na primers suas an abhainn agus sìos an abhainn a bhith ro mhòr.

Tha an susbaint G + C eadar 40% agus 60%, agus 45-55% as fheàrr.
Tha an luach TM eadar 58-62 ceum.
Feuch ri primer dimers agus fèin-dimers a sheachnadh, (na bi a’ nochdadh barrachd air 4 paidhrichean de bhunaitean co-phàirteach leantainneach) structar hairpin, mura h-eil e do-sheachanta, dèan ΔG <4.5kJ/mol * Mura h-urrainn dhut dèanamh cinnteach gun deach gDNA a thoirt air falbh aig àm ath-sgrìobhadh cùil Glan, tha e nas fheàrr primers an intron * 3 ′ / GC a dhealbhadh agus chan urrainn dhut crìoch a chur air roinnean saidhbhir ATC, atharraichte A, agus seachnadh roinnean saidhbhir. -3) primers agus neo-
sònraichte Tha homology an t-sreath leudaichte heterogeneously nas lugha na 70% no tha 8 homology bunaiteach co-phàirteach.
Stòr-dàta:
Rannsachadh CottonFGD a rèir prìomh fhaclan
Dealbhadh primer:
Dealbhadh primer IDT-qPCR

Duilleag inneal dealbhaidh primer air-loidhne Fig2 IDT

Taisbeanadh duilleag toradh Fig3
Dealbhadh primers lncRNA:
lncRNA:na h-aon cheumannan ri mRNA.
miRNA:Prionnsabal an dòigh lùb-gas: Leis gu bheil a h-uile miRNAn nan sreathan goirid de mu 23 nt, chan urrainnear lorg PCR dìreach a dhèanamh, agus mar sin thathas a’ cleachdadh an inneal sreath cas-lùb.Is e DNA aon-shreath de mu 50 nt a th’ anns an t-sreath cas-lùb, a dh’ fhaodas structar falt a chruthachadh leis fhèin.3 'Faodar an deireadh a dhealbhadh mar shreath a tha co-chòrdail ris a' chriomag pàirt de miRNA, an uairsin faodar an miRNA targaid a cheangal ris an t-sreath cas-lùb rè ath-sgrìobhadh cùil, agus faodaidh an fhaid iomlan ruighinn 70bp, a tha a rèir fad an toraidh leudaichte air a dhearbhadh le qPCR.Dealbhadh primer miRNA earbaill.
Dearbhadh sònraichte airson leudachadh:
Stòr-dàta spreadhaidh air-loidhne: CottonFGD spreadhadh a rèir sreath coltach
Sèididh ionadail: Thoir sùil air a bhith a’ cleachdadh Blast + gus spreadhadh ionadail a dhèanamh, faodaidh linux agus macos stòr-dàta ionadail a stèidheachadh gu dìreach, faodar siostam win10 a dhèanamh cuideachd às deidh dhut ubuntu bash a chuir a-steach.Cruthaich stòr-dàta spreadhaidh ionadail agus spreadhadh ionadail;fosgail ubuntu bash air win10 .
Sanas: Is e bàrr tetraploid a th’ ann an cotan àrd-thalamh agus cotan eilean mara, agus mar sin bidh toradh spreadhaidh gu tric dà gheama no barrachd.San àm a dh’ fhalbh, le bhith a’ cleachdadh NAU cds mar stòr-dàta airson spreadhadh a dhèanamh tha e dualtach dà ghine homologous a lorg le dìreach beagan eadar-dhealachaidhean SNP.Mar as trice, chan urrainnear an dà ghine homologous a sgaradh le dealbhadh primer, agus mar sin thathas gan làimhseachadh mar an aon rud.Ma tha indel follaiseach ann, mar as trice bidh am primer air a dhealbhadh air an indel, ach dh ’fhaodadh seo leantainn gu structar àrd-sgoile a’ phrìomhaire Bidh an lùth an-asgaidh a ’fàs nas àirde, a’ leantainn gu lùghdachadh ann an èifeachdas leudachaidh, ach tha seo do-sheachanta.

A 'lorg structar àrd-sgoile primer:
Ceumannan:fosgail oligo 7 → sreath teamplaid cuir a-steach → dùin fo-uinneig → sàbhail → lorg primer air an teamplaid, brùth ctrl + D gus fad primer a shuidheachadh → dèan sgrùdadh air diofar structaran àrd-sgoile, leithid bodhaig fèin-thomhas, heterodimer, hairpin, mì-chothromachadh, msaa.Tha toradh an primer aghaidh math, chan eil structar dimer agus hairpin follaiseach ann, chan eil bunaitean co-phàirteach leantainneach ann, agus tha luach iomlan lùth an-asgaidh nas ìsle na 4.5, fhad ‘s a tha am primer cùil a’ sealltainn leantainneach Tha na 6 bunaitean co-phàirteach, agus is e an lùth an-asgaidh 8.8;A bharrachd air an sin, tha dimer nas cunnartaiche a’ nochdadh aig a’ cheann 3 ′, agus tha dimer de bhunaitean 4 an dèidh a chèile a’ nochdadh.Ged nach eil an lùth an-asgaidh àrd, faodaidh an 3 ′ dimer Chl buaidh mhòr a thoirt air sònrachas leudachaidh agus èifeachdas leudachaidh.A bharrachd air an sin, feumar sgrùdadh a dhèanamh airson bannan fuilt, heterodimers, agus mì-chothromachadh.

Toraidhean lorg Fig3 oligo7
Dearbhadh èifeachdas leudachaidh:
Tha èifeachdas leudachaidh freagairt PCR gu mòr a’ toirt buaidh air toraidhean PCR.Cuideachd ann an qRT-PCR, tha an èifeachdas leudachaidh gu sònraichte cudromach airson na toraidhean cainneachdail.Thoir air falbh stuthan, innealan agus protocolaidhean eile anns a’ bhufair freagairt.Tha buaidh mhòr aig càileachd nan primers air èifeachdas leudachaidh qRT-PCR.Gus dèanamh cinnteach à neo-mhearachdachd nan toraidhean, feumaidh an dà chuid an tomhas fluorescence coimeasach agus an tomhas fluorescence iomlan èifeachdas leudachaidh nan primers a lorg.Thathas ag aithneachadh gu bheil an èifeachdas leudachaidh qRT-PCR èifeachdach eadar 85% agus 115%.Tha dà dhòigh ann:
1. Modh lùb àbhaisteach:
a.Measgaich cDNA
b.Meudachadh caisead
c.qPCR
d.Co-aontar ais-tharraing sreathach gus obrachadh a-mach èifeachdas leudachaidh
2. LinRegPCR
Tha LinRegPCR na phrògram airson mion-sgrùdadh air Dàta RT-PCR fìor-ùine, ris an canar cuideachd dàta cainneachdail PCR (qPCR) stèidhichte air SYBR Green no ceimigeachd coltach ris.Bidh am prògram a’ cleachdadh dàta ceartaichte neo-bhun-loidhne, a’ dèanamh ceartachadh bun-loidhne air gach sampall Air leth, a’ dearbhadh uinneag loidhne-loidhne agus an uairsin a’ cleachdadh mion-sgrùdadh sreathach air ais gus loidhne dhìreach a chur tro sheata dàta PCR.Bho leathad na loidhne seo tha èifeachdas PCR gach sampall fa leth air a thomhas.Thathas a’ cleachdadh an èifeachd PCR cuibheasach gach amplicon agus an luach Ct gach sampall gus dùmhlachd tòiseachaidh gach sampall obrachadh a-mach, air a chuir an cèill ann an aonadan flùraiseach neo-riaghailteach.Tha cuir a-steach agus toradh dàta tro spreadsheet Excel.Sampall a-mhàin
tha feum air measgachadh, chan eil caisead ann
ceumannan a tha a dhìth:(Gabh Bole CFX96 mar eisimpleir, chan e inneal buileach le ABI soilleir)
deuchainn:is e deuchainn àbhaisteach qPCR a th’ ann.
Toradh dàta qPCR:Faodaidh LinRegPCR dà sheòrsa de fhaidhlichean toraidh aithneachadh: RDML no toradh meudachaidh meudachaidh.Gu dearbh, is e luach lorg fìor-ùine an àireamh baidhsagal agus comharra fluorescence leis an inneal, agus gheibhear an leudachadh le bhith a’ dèanamh anailis air luach atharrachaidh fluorescence èifeachdas earrann sreathach.
Taghadh dàta: Gu teòiridheach, bu chòir an luach RDML a bhith air a chleachdadh.Thathas den bheachd gur e duilgheadas a’ choimpiutair agam nach urrainn don bhathar-bog RDML aithneachadh, agus mar sin tha an luach toraidh excel agam mar an dàta tùsail.Thathas a’ moladh sgrìonadh garbh den dàta a dhèanamh an-toiseach, leithid fàilligeadh air sampallan a chuir ris, msaa.

Fig5 qPCR dàta às-mhalairt

Fig6 taghadh de shamhlaichean tagraiche

Cuir a-steach dàta:Toradh leudachaidh teisteanais fosgailte.xls, → fosgail LinRegPCR → faidhle → leugh bho excel → tagh paramadairean mar a chithear ann am Figear 7 → Ceart gu leòr → cliog air bun-loidhne

Fig7 ceumannan cuir a-steach dàta linRegPCR

Toradh:Mura h-eil ath-aithris ann, chan eil feum air buidheann.Ma tha ath-aithris ann, faodar am buidheann a dheasachadh anns a’ bhuidheann sampall, agus tha ainm a’ ghine air a chuir a-steach don aithnichear, agus an uairsin thèid an aon ghine a chuir còmhla gu fèin-ghluasadach.Mu dheireadh, cliog air an fhaidhle, às-mhalairt excel, agus faic na toraidhean.Thèid èifeachdas leudachaidh agus toraidhean R2 gach tobar a thaisbeanadh.San dàrna h-àite, ma roinneas tu ann am buidhnean, thèid an èifeachdas leudachaidh cuibheasach ceart a thaisbeanadh.Dèan cinnteach gu bheil èifeachdas leudachaidh gach primer eadar 85% agus 115%.Ma tha e ro mhòr no ro bheag, tha e a’ ciallachadh gu bheil èifeachdas leudachaidh an primer truagh.

Fig 8 Toradh agus toradh dàta

Pròiseas deuchainneach:
Riatanasan càileachd RNA:
Purity:1.7Tha 2.0 a’ nochdadh gum faodadh isothiocyanate iarmharach a bhith ann.Bu chòir searbhag niuclasach glan A260/A230 a bhith timcheall air 2 .Ma tha sùghadh làidir aig 230 nm, tha e a’ nochdadh gu bheil todhar organach ann leithid ions phenate.A bharrachd air an sin, faodar a lorg le electrophoresis gel agarose 1.5%.Comharraich an comharra, leis nach eil dì-nàdarachadh aig an ssRNA agus nach eil dàimh sreathach aig an logarithm cuideam moileciuil, agus chan urrainnear an cuideam moileciuil a chuir an cèill gu ceart.dùmhlachd: Gu teòiridheachchan eilnas lugha na 100ng / ul, ma tha an dùmhlachd ro ìosal, mar as trice tha an purrachd ìosal gun a bhith àrd

Fig9 gel RNA

A bharrachd air an sin, ma tha an sampall luachmhor agus an dùmhlachd RNA àrd, thathas a’ moladh a thoirt seachad às deidh a thoirt a-mach, agus an RNA a chaolachadh gu dùmhlachd deireannach de 100-300ng / ul airson ath-sgrìobhadh air ais.Annspròiseas tar-sgrìobhaidh air ais, nuair a thèid mRNA ath-sgrìobhadh, thathas a’ cleachdadh primers oligo (dt) a dh’ fhaodas ceangal gu sònraichte ri earbaill polyA airson ath-sgrìobhadh air ais, fhad ‘s a bhios lncRNA agus circRNA a’ cleachdadh primers hexamer air thuaiream (Random 6 mer) airson ath-sgrìobhadh air ais de RNA iomlan Airson miRNA, thathas a’ cleachdadh primers lùb-amhaich sònraichte airson miRNA.Tha mòran chompanaidhean a-nis air innealan earbaill sònraichte a chuir air bhog.Airson an dòigh stem-loop, tha an dòigh earbaill nas goireasaiche, àrd-thoradh, agus sàbhaladh reagent, ach cha bu chòir buaidh eadar-dhealachadh miRNAn den aon teaghlach a bhith cho math ris an dòigh lùb-gas.Tha riatanasan aig gach pasgan tar-sgrìobhaidh cùil airson a bhith a’ cruinneachadh primers sònraichte gine (lùbagan cas).Is e an t-iomradh a-staigh a thathar a’ cleachdadh airson miRNA U6.Ann am pròiseas tionndadh cas-lùb, bu chòir tiùb de U6 a thionndadh air ais air leth, agus bu chòir na primers aghaidh is cùil de U6 a chuir ris gu dìreach.Faodaidh an dà chuid circRNA agus lncRNA HKGn a chleachdadh mar iomradh a-staigh.Annslorg cDNA,
mura h-eil duilgheadas ann le RNA, bu chòir cDNA a bhith ceart gu leòr cuideachd.Ach, ma thèid foirfeachd an deuchainn a leantainn, tha e nas fheàrr gine iomraidh a-staigh (Gine iomraidh, RG) a chleachdadh a dh’ aithnicheas gDNA bho cds.San fharsaingeachd, is e gine cumail-taighe a th’ ann an RG., HKG) mar a chithear ann am Figear 10;Aig an àm sin, bha mi a’ dèanamh pròtain stòraidh soybean, agus chleachd mi actin7 anns an robh introns mar iomradh a-staigh.B’ e meud a’ chriomag leudaichte den primer seo ann an gDNA 452bp, agus nan deidheadh ​​cDNA a chleachdadh mar theamplaid, b’ e 142bp a bh’ ann.An uairsin lorg toraidhean an deuchainn gu robh pàirt den cDNA air a thruailleadh le gDNA, agus dhearbh e cuideachd nach robh duilgheadas sam bith ann le toradh ath-sgrìobhadh cùil, agus dh’ fhaodadh e a bhith air a chleachdadh mar theamplaid airson PCR.Tha e gun fheum a bhith a’ ruith electrophoresis gel agarose gu dìreach le cDNA, agus is e còmhlan sgaoilte a th’ ann, nach eil cinnteach.

Fig 10 lorg cDNA

Co-dhùnadh air suidheachaidhean qPCRsa chumantas chan eil duilgheadas sam bith ann a rèir protocol a’ chit, sa mhòr-chuid ann an ceum luach tm.Mura h-eil cuid de phrìomhairean air an deagh dhealbhadh rè dealbhadh primer, agus mar thoradh air sin bidh eadar-dhealachadh mòr eadar an luach tm agus an teòiridheach 60 ° C, thathas a’ moladh an cDNA Às deidh na sampallan a mheasgachadh, ruith caisead PCR le primers, agus feuch ri seachain an teòthachd gun bannan a shuidheachadh mar luach TM.

Mion-sgrùdadh dàta

Tha an dòigh giollachd PCR cainneachdail àbhaisteach fluorescence gu bunaiteach a rèir 2- CT.Teamplaid airson làimhseachadh dàta.

Bathar co-cheangailte:

Fìor-ùine PCR Easy^TM – Thaobh

Fìor-ùine PCR Easy^TM —SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix airson a’ chiad shreath cDNA synthesis)

RT Easy II (Master Premix airson a’ chiad shreath cDNA synthesis airson qPCR)