Tha a h-uile duine a ’bruidhinn mu phrionnsapal deuchainn qRT-PCR, dealbhadh primer, mìneachadh toraidh, msaa, ach tha mi a’ smaoineachadh gum bu chòir dhomh obrachadh deuchainneach qRT-PCR a cho-roinn riut.Tha e beag, ach tha e mu dheidhinn toraidhean.
Mus dèan sinn qRT-PCR, feumaidh tuigse shoilleir a bhith againn air na dòighean RNA agus obrachaidh againn fhèin.Às deidh na h-uile, tha ar n-oidhirpean ag amas air toraidhean fhaighinn, seach dìreach a bhith ag obair.Mar sin mus dèan sinn qRT-PCR, feumaidh sinn na cùisean a leanas a dhearbhadh (cuid dhiubh a tha a’ buntainn a-mhàin ri SYBR).
1 A bheil thu cinnteach nach eil an RNA agad air a dhol sìos?
Chan urrainn dha NanoDrop 2000 ach dùmhlachd agus purrachd RNA a lorg, ach chan urrainn dha ionracas RNA a lorg.
Faodaidh luach RNA (Àireamh Intesity RNA) ionracas an RNA a nochdadh, a tha air a lorg leis an t-siostam Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagram sgeamach de luachan RIN airson diofar shamhlaichean RNA (eukaryotes)
Ach, mar as trice chan eil Agilent 2100 Bioanalyzer aig deuchainn-lannan.Anns a ’chùis seo, is urrainn dhuinn lorg tro gel formaldehyde, ach tha an riatanas airson an àireamh iomlan de RNA àrd, agus mar sin is e an dòigh as luaithe electrophoresis gel àbhaisteach a chleachdadh.Feumaidh e a bhith ann an àrainneachd gun nuclease, agus mar sin feumar an tanca electrophoresis, botal sol, bracaid gel agus cìr a nighe le uisge DEPC.Tha an agarose cuideachd saor bho nuclease (fhad ‘s a tha e air fhosgladh às ùr), agus bu chòir am Bufair Loading fhosgladh cho mòr‘ s as urrainn, le gel 1.2%.
Thoir an aire gum feum an gel a bhith air a sgaoileadh gu tur, air neo bidh e ag adhbhrachadh bannan neo-àbhaisteach, mar a chithear ann an sampall 9 san fhigear.Ma tha an bholtadh ro àrd no ma tha e a’ ruith ro fhada cruthaichidh e teas agus adhbharaichidh e truailleadh RNA, agus mar sin bu chòir smachd reusanta a chumail air an bholtadh agus an ùine.A bharrachd air an sin, faodaidh ruith gel cuideachd faighinn a-mach a bheil fuigheall DNA anns an sampall, agus faicinn a bheil àireamh mhòr de chòmhlain glèidhte anns an tobar sgaoilidh.
Figear.Lorg electrophoresis gel de RNA
2 A bheil thu cinnteach mu cho mòr sa tha an cDNA agad?
Is e eòlas nam bràithrean mòra san obair-lann gu bheil an cDNA den t-siostam 20 ul a gheibhear le gach tionndadh air a lagachadh gu dìreach 20X, fhad ‘s a tha na peathraichean iar-dhotaireil air an lagachadh 10X.Mar as trice bidh mi an urra ris an t-suidheachadh.Leis gu bheil càileachd an RNA a tha air ainmeachadh le gach neach eadar-dhealaichte, tha an ìre tionndaidh eadar-dhealaichte cuideachd, agus is dòcha nach bi an teicneòlas tionndaidh seasmhach.
Mar sin a h-uile uair a gheibh mi an cDNA air ais, bidh mi ga lagachadh an toiseach timcheall air 3 tursan, agus an uairsin cleachdaidh mi an gine gleidhidh taighe gus RT-PCR a dhèanamh, mar as trice is e 25 cearcall an àireamh de chuairtean, gus an dùmhlachd sònraichte a chomharrachadh, agus an uairsin co-dhùnadh am bàillidh caolachaidh deireannach.
3 A bheil thu cinnteach gu bheil na primers agad furasta an cleachdadh?
Faodaidh e a dhol seachad air lùb leaghaidh qRT-PCR, ach tha seo fhathast a’ cosg airgead.Airson deuchainn-lannan gun mòran airgid, nuair a gheibh iad tòrr primers, faodaidh iad RT-PCR àbhaisteach a chleachdadh gus faicinn an e còmhlan singilte a th’ ann agus sònrachas nan primers a chomharrachadh.Mura h-eil an obair-lann gann de airgead, faodar sònrachas gach primers aithneachadh aon uair tron lùb leaghaidh.
4 A bheil thu cinnteach gu bheil na suidheachaidhean deuchainneach agad freagarrach?
Bu chòir SYBR a bhith air a dhìon bho sholas làidir, mar sin feuch ris an t-solas os cionn a chuir dheth nuair a chuireas tu reagent SYBR ris, agus cha leig thu leas ach solas beag a chleachdadh airson a chrìochnachadh.
Stòr SYBR aig 4 ° C.Nuair a thathar gan cleachdadh, tionndaidh gu socair suas is sìos gus measgachadh gu math gus foam a sheachnadh, agus na bi a’ tionndadh gu làidir.
Is toil le cuid de pheathraichean nas òige comharran a tharraing air a’ bhòrd PCR air eagal ’s gum measgachadh iad na sampallan, rud a tha ceàrr.Leis gu bheil na comharran agad gu math dualtach buaidh a thoirt air cruinneachadh comharran flùraiseach, mar as trice bidh mi a’ moladh do dhaoine òga leabhraichean notaichean deuchainneach a chleachdadh gus cuimhne a chuideachadh, mar a chithear gu h-ìosal.
Figear.diagram luchdachadh sampall qRT-PCR
5 A bheil thu cinnteach gu bheil thu ga dhèanamh ceart?
Dèan cinnteach gum bi miotagan ort, a’ caitheamh mhiotagan, a’ caitheamh mhiotagan, agus ag ràdh rudan cudromach trì tursan.
Gus an nochd SYBR gu solas a lughdachadh, is toil leam gu pearsanta teamplaid a chuir ris an toiseach, mar a chithear san fhigear gu h-ìosal.A rèir an eòlais, tha coltas ann gum bi mearachdan samplachaidh ann le bhith a’ cur beagan teamplaid ris.Mar sin, gus a’ mhearachd a dh’ adhbhraichear le bhith a’ cur beagan teamplaid a chur ris, mar as trice bidh mi a’ dùblachadh an t-sampall a-rithist, agus a’ dùblachadh an t-sùim nuair a chuireas mi an sampall ris gus an ìre de H2O2 a chur ris a lughdachadh.
Figear.Diagram sgeama de luchdachadh qRT-PCR
An uairsin rèiteachadh an siostam qRT-PCR mar a leanas.
Figear.Diagram ullachaidh siostam qRT-PCR
NOTA: Feumar am pròiseas rèiteachaidh a dhèanamh air deigh.
Às deidh an sampall a chuir ris, cuir a-steach am film ròin follaiseach.Feuch gun a bhith a 'beantainn ri uachdar an fhilm ròin follaiseach le do làmhan, dìreach obraich bhon àite air gach taobh den fhilm.Leis gum faodadh lorgan-meòir cuideachd buaidh a thoirt air cruinneachadh comharran flùraiseach.An uairsin cleachd centrifuge gu centrifuge gu sgiobalta airson 10 s aig astar ìosal gus casg a chuir air an sampall bho bhith a ’crochadh air a’ bhalla.
Bathar co-cheangailte:
Ùine puist: Giblean-28-2023
