Tha COVID-19 na ghalar gabhaltach air adhbhrachadh le Syndrome analach Trom Acrach Coronavirus Seòrsa 2. Nuair a tha neach air a ghalachadh, tha na comharran as cumanta a’ toirt a-steach fiabhras, casadaich, agus giorrad analach.

Faodar na sampallan a thathar a’ cleachdadh airson deuchainn a chruinneachadh le swaban nasopharyngeal no swabs oropharyngeal.

Dè a th' ann am PCR?

Is e an dòigh àbhaisteach airson lorg coronavirus ath-bhualadh slabhraidh polymerase, PCR.Tha an dòigh seo air a chleachdadh gu farsaing ann am bith-eòlas moileciuil.Faodaidh e milleanan a chopaigeadh gu billeanan de mhìrean DNA sònraichte.

Anns a ’coronavirus ùr tha genoma RNA aon-shreath glè fhada.Gus na bhìorasan sin a lorg le PCR, feumaidh moileciuilean RNA a bhith air an tionndadh gu na sreathan DNA co-phàirteach aca le ath-sgrìobhadh cùil, agus an uairsin faodar an DNA a tha air ùr-shìneadh a mheudachadh le modhan àbhaisteach PCR, ris an canar gu cumanta RT-PCR.

Pròiseas RT-PCR

às-tharraing RNA

Gus an dòigh seo a choileanadh, bu chòir RNA viral a thoirt a-mach gu bunaiteach.Faodar measgachadh de ghoireasan glanaidh RNA a chleachdadh airson dealachadh goireasach, luath agus èifeachdach.

Gus RNA viral a thoirt a-mach a ’cleachdadh pasgan malairteach, cuir an sampall an-toiseach gu tiùb microcentrifuge agus an uairsin measgachadh e leis a’ bhufair lysis.Tha am bufair seo gu math dì-nàdurrach agus mar as trice tha e air a dhèanamh suas de phenol agus guanidine isothiocyanate.A bharrachd air an sin, mar as trice bidh luchd-dìon RNase an làthair anns a ’bhufair lysis gus dèanamh cinnteach à aonaranachd RNA viral iomlan.

Às deidh am bufair lysis a chuir ris, vortex an tiùb measgachaidh le builleag agus goir aig teòthachd an t-seòmair.Tha am bhìoras an uairsin air a lìomhadh fo chumhachan fìor neo-nàdurrach a bheir am bufair lysis seachad.

Às deidh an sampall a bhith air a lìomhadh, thèid tiùb centrifuge a chleachdadh airson a ’mhodh glanaidh.Tha an sampall air a luchdachadh a-steach don tiùb centrifuge agus an uairsin air a centrifuge.

Tha am modh-obrach seo na dhòigh às-tharraing ìre cruaidh anns a bheil an ìre pàipearachd a’ toirt a-steach matrix gel silica.

Fo chumhachan salainn is pH as fheàrr, bidh moileciuilean RNA a’ ceangal ris an membran silica.

Aig an aon àm, thèid pròtain agus stuthan truaillidh eile a thoirt air falbh.

Às deidh centrifugation, cuir an tiùb centrifuge a-steach do phìob cruinneachaidh glan, cuir air falbh an sìoltachan, agus an uairsin cuir bufair nighe ris.

Cuir an tiùb anns an centrifuge a-rithist gus am bufair nighe a sparradh tron ​​​​membran.Bheir seo air falbh a h-uile neo-chunbhalachd a tha air fhàgail bhon membran, a’ fàgail dìreach an RNA ceangailte ris an gel silica.

Às deidh an sampall a bhith air a nighe, cuir an tiùb a-steach do phìob microcentrifuge glan agus cuir am bufair elution ris.

Tha e an uairsin air a centrifuged gus am bufair elution a sparradh tron ​​​​membran.Bidh am bufair elution a’ toirt air falbh RNA viral bhon cholbh snìomh agus a’ faighinn RNA fìor-ghlan saor bho phròtainean, luchd-dìon agus stuthan truaillidh eile.

Ceum 2

Dùmhlachadh measgaichte

Às deidh an RNA viral a thoirt a-mach, is e an ath cheum am measgachadh ath-bhualadh ullachadh airson leudachadh PCR.Anns a 'cheum seo, thathar a' cleachdadh dùmhlachd.Tha am fuasgladh dùmhail seo na fhuasgladh tiugh ro-mheasgaichte anns a bheil premix, reverse transcriptase, nucleotides, primer air adhart, primer cùil, probe TaqMan agus DNA polymerase.

Mu dheireadh, gus am measgachadh ath-bhualadh seo a chrìochnachadh, thèid an teamplaid RNA a chur ris.Tha na tiùban air an measgachadh le vortexing cuisle, agus an uairsin tha am measgachadh ath-bhualadh air a luchdachadh a-steach don truinnsear PCR.Mar as trice bidh 96 tobraichean anns a’ phlàta PCR agus is urrainn dhaibh grunn shampaill a sgrùdadh aig an aon àm.

Ceum 3

Meudachadh PCR

An ath rud, cuir am plàta anns an inneal PCR, a tha gu ìre mhòr na chearcall teirmeach.

Thathas a’ cleachdadh RT-PCR fìor-ùine gus an coronavirus nobhail 2019 a lorg le bhith ag àrdachadh an t-sreath targaid ann an gine RdrRP, gine E agus gine N.Tha an taghadh de ghine targaid an urra ris an t-sreath primer agus probe.

Is e a’ chiad cheum de RT-PCR tar-sgrìobhadh cùil.Tha a’ chiad shreath de DNA co-phàirteach air a cho-chur, a tha air a thòiseachadh leis a’ phrìomhaire cùil PCR, a tha a’ ceangal ris a’ phàirt taiceil den genoma RNA viral.An uairsin cuir air ais transcriptase nucleotides DNA gu deireadh 3 ′ den primer gus DNA a cho-chur ris an RNA viral.Tha teòthachd agus fad a’ cheum seo an urra ris na primers, an RNA targaid, agus an transcriptase cùil a thathar a’ cleachdadh.

An ath rud, thèid ceum dì-nàdurachaidh tùsail a chuir an sàs, a thig gu dì-nàdarachadh an hybrid RNA-DNA.Tha an ceum seo riatanach gus an DNA polymerase a ghnìomhachadh.Aig an aon àm, tha transcriptase air ais neo-ghnìomhach.

Tha PCR air a dhèanamh suas de shreath de chuairtean teirmeach.Tha gach cearcall a’ gabhail a-steach ceumannan dì-nàdurachaidh, annealing agus leudachaidh.

Tha an ceum dì-nàdurachaidh a’ toirt a-steach a bhith a’ teasachadh an t-seòmar freagairt gu 95 ceum Celsius agus ga chleachdadh airson an teamplaid DNA dà-shreath a dhì-nàdarachadh.

Anns an ath cheum, tha an teòthachd ath-bhualadh air a lughdachadh gu 58 ceum Celsius, a ’leigeil leis a’ phrìomhaire air adhart a bhith a ’ceangal ris a’ phàirt taiceil den teamplaid DNA aon-shreath aige.Tha an teòthachd annealing gu dìreach an urra ri fad agus co-dhèanamh an primer.

Anns a 'cheum leudachaidh, bidh an DNA polymerase a' co-chur sreathan DNA ùr a tha a 'cur ris an t-sreath teamplaid DNA.Le bhith a’ cur niuclasan an-asgaidh ris an teamplaid anns an t-slighe 5 ′ gu 3 ′ bhon mheasgachadh freagairt.Tha teòthachd a 'cheum seo an urra ris an DNA polymerase a thathar a' cleachdadh.

Às deidh a’ chiad chearcall, gheibhear targaid DNA le dà shreath.

An uairsin cuir a-steach an dàrna cearcall.Tha an DNA dà-shreath air a dhì-nàdarachadh gus dà mholacile DNA aon-shreath a thoirt gu buil.

Anns an ath cheum, tha an teòthachd ath-bhualadh air a lughdachadh, tha na primers air an ceangal ri gach teamplaid DNA aon-shreath, agus tha an probe Taq-man air a cheangal ris a ’phàirt taiceil den DNA targaid.

Tha an probe TaqMan air a dhèanamh suas de fluorophore ceangailte gu covalent ri ceann 5 ′ den probe oligonucleotide.Nuair a bhios e air bhioran le stòr solais an rothaiche, bidh am fluorophore a’ leigeil a-mach fluorescence.A bharrachd air an sin, tha an probe air a dhèanamh suas de quencher aig a’ cheann 3 ′.Tha cho faisg ‘s a tha gine an neach-aithris don quencher a’ cur casg air lorg fluorescence.

Anns a 'cheum leudachaidh, bidh an DNA polymerase a' co-chur sreathan ùr.Nuair a ruigeas am polymerase an probe TaqMan, bidh an gnìomhachd in-ghnèitheach 5′nuclease aige a’ sgoltadh an probe, a’ sgaradh an dath bhon quencher.

Le gach cearcall de PCR, thèid barrachd mholacilean dath a leigeil ma sgaoil, agus mar thoradh air sin bidh àrdachadh ann an dian fluorescence a rèir an àireamh de amplicons air an co-chur.

Tha an dòigh seo a’ ceadachadh tuairmse a dhèanamh air an àireamh de shreath a chaidh a thoirt seachad a tha an làthair anns an sampall.Bidh an àireamh de mhìrean DNA le sreathan dùbailte a’ dùblachadh anns gach cearcall.Mar sin, faodar PCR a chleachdadh gus sampallan glè bheag a sgrùdadh.

Airson comharra flùraiseach a thomhas, lampa halogen tungstain, criathrag excitation, sgàthan, lionsa, sìoltachan sgaoilidh agus camara CCD ceangailte ri cosgais inneal.

Ceum 4 Lorg

Airson comharra flùraiseach a thomhas, lampa halogen tungstain, criathrag excitation, sgàthan, lionsa, sìoltachan sgaoilidh agus camara CCD ceangailte ri cosgais inneal.

Tha an solas sìoltaichte bhon lampa air a nochdadh leis an sgàthan, a ’dol tron ​​​​lionsa condenser, agus air a chuimseachadh gu meadhan gach toll.An uairsin tha an fluorescence a thèid a leigeil a-mach às an toll air a nochdadh bhon sgàthan, a ’dol tron ​​​​shìoltachan sgaoilidh, agus air a lorg le camara CCD.Anns gach cearcall PCR, faodaidh an CCD an solas fluorophore fèin-bhrosnaichte a lorg.

Bidh e ag atharrachadh an t-solais a chaidh a ghlacadh gu dàta didseatach.Canar PCR fìor-ùine ris an dòigh seo, agus leigidh e sgrùdadh fìor-ùine air adhartas freagairt PCR.