Tha PCR (freagairt slabhraidh polymerase) mar aon de na teicneòlasan leudachaidh DNA in-vitro, le eachdraidh de chòrr air 30 bliadhna.

Chaidh teicneòlas PCR a thòiseachadh le Kary Mullis à Cetus, na SA ann an 1983. Chuir Mullis a-steach airson patent PCR ann an 1985 agus dh'fhoillsich e a' chiad phàipear acadaimigeach PCR air Saidheans san aon bhliadhna.Bhuannaich Mullis an Duais Nobel ann an Ceimigeachd ann an 1993 airson a chuid obrach.

Prionnsabalan bunaiteach PCR

Faodaidh PCR mìrean DNA targaid àrdachadh còrr is millean uair.Tha am prionnsapal fo catalysis DNA polymerase, a’ cleachdadh DNA dualan pàrant mar theamplaid agus primer sònraichte mar thoiseach tòiseachaidh airson leudachadh.Tha e air ath-aithris in vitro tro cheumannan leithid dì-nàdurachadh, annealing, agus leudachadh.Pròiseas DNA iallan nighean a’ cur ris an teamplaid dualan pàrant DNA.

Tha am pròiseas àbhaisteach PCR air a roinn ann an trì ceumannan:

1.Denaturation: Cleachd teòthachd àrd gus iallan dùbailte DNA a sgaradh.Tha an ceangal hydrogen eadar iallan dùbailte DNA air a bhriseadh aig teòthachd àrd (93-98 ℃).

2.Annealing: Às deidh an DNA dà-shreath a bhith air a sgaradh, lughdaich an teòthachd gus an urrainn don primer ceangal ris an DNA aon-shreath.

3.Extension: Bidh an DNA polymerase a 'tòiseachadh a' co-chur sreathan co-phàirteach air na sreathan DNA bho na prìomhairean a tha air an ceangal nuair a thèid an teòthachd sìos.Nuair a bhios an leudachadh deiseil, thèid cearcall a chrìochnachadh, agus bidh an àireamh de phìosan DNA a’ dùblachadh

Le bhith a 'toirt air ais na trì ceumannan sin 25-35 tursan, bidh an àireamh de mhìrean DNA a' dol am meud gu mòr.

Is e innleachdas PCR gum faodar diofar primers a dhealbhadh airson diofar ghinean targaid, gus an tèid pìosan gine targaid àrdachadh ann an ùine ghoirid.

Gu ruige seo, faodar PCR a roinn ann an trì roinnean, is e sin PCR àbhaisteach, PCR cainneachdail fluorescent agus PCR didseatach.

A 'chiad ghinealach de PCR àbhaisteach

Cleachd ionnstramaid leudachaidh PCR àbhaisteach gus an gine targaid àrdachadh, agus an uairsin cleachd electrophoresis gel agarose gus an toradh a lorg, chan urrainnear ach mion-sgrùdadh càileachdail a dhèanamh.

Na prìomh eas-bhuannachdan a tha aig a 'chiad ghinealach PCR:

1.Prone gu leudachadh neo-shònraichte agus toraidhean dearbhach meallta.

2.Tha an lorg a 'toirt ùine mhòr agus tha an obrachadh duilich.

3.Only deuchainn càileachdail urrainn a dhèanamh

An dàrna ginealach PCR fìor-ùine

Bidh PCR fìor-ùine, ris an canar cuideachd qPCR, a’ cleachdadh probes flùraiseach a dh’ fhaodadh adhartas an t-siostam ath-bhualadh a chomharrachadh, agus a ’cumail sùil air cruinneachadh thoraidhean meudaichte tro bhith a’ cruinneachadh comharran flùraiseach, agus a ’breithneachadh nan toraidhean tron ​​​​lùb flùraiseach.Faodar a thomhas le cuideachadh bho luach Cq agus lùb àbhaisteach.

Leis gu bheil an teicneòlas qPCR air a dhèanamh ann an siostam dùinte, tha an coltachd truailleadh air a lughdachadh, agus faodar sùil a chumail air a ’chomharra fluorescence airson lorg cainneachdail, agus mar sin is e an cleachdadh as fharsainge ann an cleachdadh clionaigeach agus tha e air a thighinn gu bhith na phrìomh theicneòlas ann am PCR.

Faodar na stuthan flùraiseach a thathas a’ cleachdadh ann am PCR cainneachdail fìor-ùine a roinn ann an: probe fluorescent TaqMan, lòchrain moileciuil agus dath flùraiseach.

1) Deuchainn flùraiseach TaqMan:

Rè leudachadh PCR, thèid probe flùraiseach sònraichte a chur ris fhad ‘s a tha e a’ cur paidhir primer ris.Is e oligonucleotide a th’ anns an probe, agus tha an dà cheann air an comharrachadh le buidheann flùraiseach neach-aithris agus buidheann flùraiseach quencher.

Nuair a tha an probe slàn, tha an comharra flùraiseach a bhios a’ bhuidheann luchd-aithris a’ sgaoileadh a-steach don bhuidheann quenching;rè leudachadh PCR, bidh gnìomhachd exonuclease 5 ′-3 ′ de enzyme Taq a’ sgoltadh agus a ’lughdachadh an probe, a’ toirt air an neach-aithris buidheann fluorescent agus quencher Tha a ’bhuidheann fluorescent air a sgaradh, gus am faigh an siostam sgrùdaidh fluorescence an comharra flùraiseach, is e sin, a h-uile uair a thèid dualan DNA a mheudachadh gu tur, tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur, tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur, agus tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur. le cruthachadh toradh PCR.

2) Dath flùraiseach SYBR:

Anns an t-siostam ath-bhualadh PCR, tha cus de dhath fluorescent SYBR air a chur ris.Às deidh dha dath fluorescent SYBR a bhith air a thoirt a-steach gu neo-shònraichte a-steach don dual-dùbailte DNA, bidh e a’ sgaoileadh comharra flùraiseach.Cha toir am moileciuil dath SYBR nach eil air a thoirt a-steach don t-seine comharra flùraiseach sam bith a-mach, agus mar sin a’ dèanamh cinnteach gu bheil an comharra flùraiseach Tha an àrdachadh ann am bathar PCR air a shioncronachadh gu tur leis an àrdachadh ann am bathar PCR.Chan eil SYBR a’ ceangal ach ri DNA dà-shreath, agus mar sin faodar an lùb leaghaidh a chleachdadh gus faighinn a-mach a bheil am freagairt PCR sònraichte.

3) Molecular beacon:

Is e probe oligonucleotide le bileag dùbailte le lùb gas a th’ ann a tha a’ cruthachadh structar falt de mu 8 bonn aig na cinn 5 agus 3.Tha na sreathan searbhag niuclasach aig gach ceann air an càradh gu co-phàirteach, ag adhbhrachadh gu bheil am buidheann flùraiseach agus a’ bhuidheann quenching teann.Dùin, cha tèid fluorescence a thoirt gu buil.

Às deidh an toradh PCR a bhith air a ghineadh, tron ​​​​phròiseas annealing, tha am pàirt meadhanach den lòchran moileciuil air a chàradh le sreath DNA sònraichte, agus tha an gine flùraiseach air a sgaradh bhon ghine quencher gus fluorescence a thoirt gu buil.

Na prìomh eas-bhuannachdan aig PCR an dàrna ginealach:

Tha dìth cugallachd fhathast, agus tha lorg sampaill leth-bhreac ceàrr mearachdach.

Tha buaidh aig a 'chùl-luach, agus tha an toradh buailteach do bhriseadh.

Nuair a tha luchd-bacadh PCR anns an t-siostam ath-bhualadh, tha na toraidhean lorg buailteach do bhacadh.

PCR didseatach treas ginealach

Bidh PCR didseatach (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) a’ tomhas àireamh leth-bhreac an t-sreath targaid tro lorg puing crìochnachaidh, agus is urrainn dhaibh lorg cainneachdail iomlan a dhèanamh gun a bhith a’ cleachdadh smachdan a-staigh agus lùban àbhaisteach.

Bidh PCR didseatach a’ cleachdadh lorg puing crìochnachaidh agus chan eil e an urra ri luach Ct (stairsneach cearcall), agus mar sin chan eil an èifeachdas leudachaidh nas lugha de bhuaidh air an ath-bhualadh PCR didseatach, agus tha an fhulangas do luchd-bacadh ath-bhualadh PCR air a leasachadh, le fìor chruinneas agus ath-riochdachadh.

Air sgàth feartan cugallachd àrd agus mionaideachd àrd, chan eil e furasta a chuir bacadh air luchd-bacadh ath-bhualadh PCR, agus faodaidh e fìor àireamhachadh iomlan a choileanadh às aonais toraidhean àbhaisteach, a tha air a thighinn gu bhith na phrìomh àite sgrùdaidh is tagraidh.

A rèir nan diofar chruthan den aonad freagairt, faodar a roinn ann an trì prìomh sheòrsan: siostaman microfluidic, chip agus droplet.

1) Microfluidic didseatach PCR, mdPCR:

Stèidhichte air an teicneòlas microfluidic, tha an teamplaid DNA air a sgaradh.Faodaidh an teicneòlas microfluidic an sampall nano-ùrachadh no gineadh boinneagan nas lugha a thoirt gu buil, ach feumaidh na boinneagan dòigh sùghaidh sònraichte agus an uairsin còmhla ris an t-siostam ath-bhualadh PCR.Tha mdPCR air a chleachdadh mean air mhean le dòighean eile nan àite.

2) PCR didseatach stèidhichte air droplet, ddPCR:

Cleachd teicneòlas gineadh droplet uisge-ann-ola gus an sampall a phròiseasadh gu boinneagan, agus roinn an siostam ath-bhualadh anns a bheil moileciuilean searbhag niuclasach a-steach do mhìltean de boinneagan nanoscale, anns gach fear anns nach eil am moileciuil targaid searbhag niuclasach ri lorg, no anns a bheil aon gu grunn mholacilean targaid searbhag niuclasach ri dhearbhadh.

3) PCR didseatach stèidhichte air chip, cdPCR:

Cleachd an teicneòlas slighe siùbhlach aonaichte gus mòran microtubes agus microcavities a ghràbhaladh air wafers silicon no glainne quartz, agus smachd a chumail air sruthadh an fhuasglaidh tro dhiofar bhalbhaichean smachd, agus roinn an sampall leaghan gu nanometers den aon mheud a-steach do na tobraichean ath-bhualadh airson PCR didseatach Reaction gus àireamhachadh iomlan a choileanadh.

Tha na prìomh eas-bhuannachdan aig an treas ginealach PCR:

Tha an uidheamachd agus na h-ath-bheachdan daor.

Tha riatanasan càileachd teamplaid àrd.Ma tha meud an teamplaid nas àirde na meud microsystem, bidh e do-dhèanta a thomhas, agus ma tha e ro bheag, thèid cruinneas an àireamhachaidh a lughdachadh.

Faodar nithean ceàrr a chruthachadh cuideachd nuair a tha leudachadh neo-shònraichte ann.