Is e RT-qPCR an deuchainn bunaiteach air bith-eòlas moileciuil, agus feumaidh a h-uile duine a bhith eòlach air.Tha e gu ìre mhòr a’ toirt a-steach trì ceumannan: às-tharraing RNA, tar-sgrìobhadh air ais gu cDNA, agus PCR cainneachdail fluorescent fìor-ùine.Chan eil e na chuideachadh, dè a tha a’ dol?Tha e coltach gu bheil duilgheadas ann lean deuchainn tar-sgrìobhaidh cùil!Ged a tha e coltach nach fheum an deuchainn tar-sgrìobhaidh cùil ach RNA, dNTP, primers, agustar-sgrìobhadh air aischun an tiùb centrifuge agus measgachadh gu math, ach anns a 'phròiseas obrachaidh fhèin, tha mòran mion-fhiosrachaidh ann fhathast air am feumar aire a thoirt.Ionnsaichidh sinn mu dheidhinn!

Ciamar a nì thu measadh air càileachd RNA?
Gus cDNA fhaighinn, tha càileachd RNA deatamach!Faodar càileachd RNA a lorg sa mhòr-chuid bho dhà thaobh:
(1) ionracas RNA:Faodar ionracas RNA a dhearbhadh le electrophoresis gel agarose. A’ gabhail eukaryotes mar eisimpleir, tha trì bannan soilleir aig an RNA iomlan iomlan, is e na cuideaman moileciuil bho mòr gu beag 28S, 18S, agus 5S, agus tha 28S dà uair cho soilleir ri 18S;ma tha trì bannan rim faicinn, ach tha an seòrsa còmhlan doilleir no tha sgaoileadh a’ ciallachadh gu bheil an RNA air a dhol sìos gu ìre.Aig an àm seo, feuch an dèan thu am freagairt tar-sgrìobhaidh cùil sa bhad agus àrdaich cuir a-steach an teamplaid gu h-iomchaidh;mura h-eil ach còmhlan le cuideam beag moileciuil no còmhlan ri fhaicinn, tha an RNA air a dhol sìos gu tur agus feumar a thoirt air falbh a-rithist.Tha Agilent 2100 a’ comharrachadh ionracas RNA le diagram stùc agus luach RIN.Ma tha an searbhag niuclasach slàn, tha bun-loidhne an electropherogram rèidh;ma tha an searbhag niuclasach air a dhol sìos gu mòr, tha a’ bhun-loidhne neo-chòmhnard agus tha barrachd stùcan truaillidh a’ nochdadh;tha luach RIN a’ nochdadh ionracas an RNA, taobh a-staigh raon 0-10, mar as motha an luach, is ann as fheàrr càileachd an RNA.Uill, mar as àirde an ìre iomlanachd.
(2) Purity RNA:Faodar an co-mheas de OD260/280 a lorg le UV spectrophotometry.Ma tha an co-mheas de OD260/280 eadar 1.9 agus 2.1, tha an purity fìor mhath.
Faodaidh DNA genomic iarmharach leantainn gu toraidhean cainneachdail mearachdach
Nuair a thèid RNA a thoirt a-mach, faodaidh an RNA a gheibh sinn a bhith air a mheasgachadh le DNA genomic (gDNA) nach deach a ghlanadh.Mar sin, bidh an cDNA às deidh tar-sgrìobhadh cùil cuideachd air a mheasgachadh legDNA.Aig àm an t-sruthqPCRfreagairt,cDNAagus faodaidh gDNA a bhith air a mheudachadh aig an aon àm, a’ ciallachadh gu bheil luach CT an ìre mhath beag ann, agus mar sin dh’ fhaodadh na toraidhean a bhith claon.
Mar sin dè a bu chòir dhuinn a dhèanamh san t-suidheachadh seo?Foregenea' moladh:
(1) Dèan glanadh genome air an RNA air ais, a dh'fhaodar a thoirt air falbh le bhith a 'toirt a-mach colbh nuair a thèid RNA a thoirt a-mach;
(2) Dèilig an RNA a chaidh a thoirt a-mach le DNaseI , ach crìochnaich e le EDTA;
de ath-bheachdan tar-sgrìobhaidh cùille modalan glanaidh genome;

Ciamar a roghnaicheas tu primers airson ath-sgrìobhadh air ais?
Bidh primers tar-sgrìobhaidh cùil cuideachd a’ toirt buaidh air toradh an ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh cùil.Faodaidh tu primers air thuaiream, Oligo dT no primers gine sònraichte a thaghadh airson ath-sgrìobhadh air ais a rèir suidheachadh sònraichte an deuchainn:
(1) Ath-sgrìobhaidhean sònraichte: thathar a 'moladh primers sònraichte gine;
(2) Ath-sgrìobhaidhean criomag fhada: Thathas a 'moladh Oligo dT/primers sònraichte gine;
(3) Mìrean a-staigh de ath-sgrìobhaidhean fada: primers sònraichte gine / primers air thuaiream / primers air thuaiream + Oligo dT.Ma thèid an deuchainn qPCR às deidh sin a dhèanamh, chan urrainnear Oligo dT a chleachdadh leis fhèin, oir faodaidh cleachdadh Oligo dT leis fhèin claonadh deireadh 3′ adhbhrachadh, a’ leantainn gu toraidhean deuchainn qPCR mearachdach;
(4) miRNA: Faodar primers cas-loop no primers earbaill a chleachdadh.

Cò mheud uair a bu chòir an toradh tar-sgrìobhaidh cùil cDNA a lagachadh airson a thomhas?
Às deidh cDNA fhaighinn den toradh tar-sgrìobhaidh cùil, tha e glè chudromach cia mheud uair a bu chòir an cDNA a lagachadh airson deuchainnean qPCR.Ma tha an dùmhlachd cDNA ro àrd no ro ìosal, dh’ fhaodadh buaidh a bhith air an èifeachdas leudachaidh.An urrainnear an dùmhlachd cDNA a thomhas, agus ciamar a bu chòir a dhèanamh?
(1) Chan urrainnear an dùmhlachd cDNA den toradh tar-sgrìobhaidh cùil a thomhas, oir a bharrachd air toradh cDNA, tha an toradh tar-sgrìobhaidh cùil cuideachd a’ toirt a-steach Bufair fuigheall tar-sgrìobhaidh cùil, transcriptase reverse, primers, msaa, a chuireas bacadh air toraidhean tomhais dùmhlachd agus a dh’ adhbharaicheas co-mheas OD260/280, OD260/230 neo-àbhaisteach agus mar sin chan eil e a’ nochdadh fìor cho-mheas cD.Aig an àm seo, canaidh cuid de charaidean, an uairsin tomhaisidh mi an dùmhlachd às deidh glanadh;an seo, bu mhath le Foregene a chuir an cuimhne nach eilear a ’moladh an cDNA a ghlanadh, leis gu bheil fad an cDNA a gheibhear leis an tionndadh eadar-dhealaichte, agus thèid an cDNA goirid a chall anns a’ ghlanadh.
(2) Mar sin dè a nì thu?Ron deuchainn qPCR, faodar caisead caolachaidh an cDNA a dhearbhadh tron ​​​​deuchainn ro-làimh .Mar eisimpleir: cleachd fuasgladh stoc cDNA, caolachadh 10-fhillte, agus caolachadh 100-fhillte mar theamplaidean airson deuchainnean qPCR, agus tagh am bàillidh caolachaidh le luach CT anns an raon de 18-28.

Ciamar a bu chòir miRNAn ath-sgrìobhadh air ais?
Tha miRNA na RNA moileciuil beag aon-shreath le meud timcheall air 22 nt nach eil a’ còdadh airson pròtain.Air sgàth cho fada ‘s a tha e, tha e duilich an dòigh àbhaisteach qPCR a thomhas gu dìreach, agus mar sin gu tric feumar miRNA a leudachadh;tha na dòighean tar-sgrìobhaidh cùil a thathas a’ cleachdadh gu cumanta airson miRNA a’ toirt a-steach modh cas-lùb agus modh earbaill.
Is e an dòigh lùb-gas am miRNA a leudachadh le bhith a’ cur primers gas-loop ris.Tha cugallachd agus sònrachas nas àirde aig an dòigh lorgaidh seo, ach tha an gluasad lorgaidh ìosal.Chan urrainn dha aon tar-sgrìobhadh cùil ach aon miRNA agus iomradh a-staigh a lorg;Tha an dòigh cuir-earbaill air a dhèanamh suas de dhà Tha e air a chrìochnachadh le co-ghnìomh dà enzymes, is iad sin PolyA polymerase agus transcriptase reverse.Tha e an urra ri PolyA polymerase earbaill PolyA a chur ri miRNA gus a fhad a mheudachadh, agus bidh transcriptase air ais a’ coileanadh ath-bhualadh tar-sgrìobhaidh air ais.Tha toradh lorgaidh àrd aig an dòigh seo agus is urrainn dha grunn miRNAn agus iomraidhean taobh a-staigh a lorg ann an aon tar-sgrìobhadh cùil, ach tha an cugallachd agus an sònrachas ìosal anns an dòigh lùb gas.