Is e luach Ct an cruth taisbeanaidh toraidh as cudromaiche de PCR cainneachdail fluorescent.Tha e air a chleachdadh gus eadar-dhealachaidhean abairt gine no àireamh leth-bhreac gine obrachadh a-mach.Mar sin dè an luach Ct a th’ ann an tomhas fluorescence air a mheas reusanta?Ciamar a nì thu cinnteach gu bheil an raon èifeachdach de luach Ct?
Dè a th’ ann an luach Ct?
Rè pròiseas leudachaidh qPCR, bidh an àireamh co-fhreagarrach de chuairtean leudachaidh (Cycle Threshold) nuair a ruigeas comharra flùraiseachd an toraidh meudaichte an stairsneach flùraiseach stèidhichte.Tha C a’ ciallachadh Cycle agus tha T a’ ciallachadh Threshold.Gu sìmplidh, is e luach Ct an àireamh de chearcaill a tha co-chosmhail ri nuair a ruigeas an leudachadh teamplaid tùsail ìre sònraichte de thoraidhean ann an qPCR.Thèid an rud ris an canar “cuid de thoraidhean” a mhìneachadh nas fhaide air adhart.
Dè a bhios luach Ct a’ dèanamh?
1.Relationship eadar leudachadh exponential, meud teamplaid agus luach Ct
Mas fheàrr, bidh ginean ann an qPCR air an cruinneachadh le leudachadh exponential às deidh grunn chuairtean.Is e an dàimh eadar an àireamh de chuairtean leudachaidh agus an àireamh de thoraidhean: Meud toraidh meudaichte = meud teamplaid tùsail × (1 + En) àireamh cearcallan.Ach, chan eil am freagairt qPCR an-còmhnaidh ann an suidheachadh air leth.Nuair a ruigeas an ìre de thoraidhean meudaichte “suim toraidh sònraichte”, is e an àireamh de chuairtean aig an àm seo an luach Ct, agus tha e anns an ùine leudachaidh exponential.An dàimh eadar luach Ct agus an ìre de theamplaid tòiseachaidh: Tha dàimh sreathach eadar luach Ct an teamplaid agus logarithm àireamh leth-bhreac tòiseachaidh an teamplaid.Mar as àirde an dùmhlachd teamplaid tùsail, is ann as lugha a bhios luach Ct;mar as ìsle an dùmhlachd teamplaid tùsail, is ann as motha a bhios luach Ct.
2.Amplification lùb, stairsneach fluorescence agus cuid de thoraidhean PCR meud
Tha an ìre de thoradh leudachaidh qPCR air a thaisbeanadh gu dìreach ann an cruth comharra fluorescent, is e sin, an lùb leudachaidh.Anns an ìre thràth de PCR, tha an leudachadh ann an suidheachaidhean air leth freagarrach, tha an àireamh de chearcaill beag, tha cruinneachadh toraidh beag, agus chan urrainnear an ìre flùraiseachd a chomharrachadh gu soilleir bho chùl-raon fluorescence.Às deidh sin, bidh an fluorescence a ‘dol am meud agus a’ dol a-steach don ìre eas-chruthach.Faodar an ìre de thoraidhean PCR a lorg aig àm sònraichte nuair a tha am freagairt PCR dìreach anns an ìre eas-chruthach, a dh’ fhaodar a chleachdadh mar “tomhas sònraichte de thoraidhean”, agus faodar susbaint tùsail an teamplaid a thoirt a-mach à seo.Mar sin, is e an stairsneach fluorescence an ìre de chomharran flùraiseach a tha co-chosmhail ri tomhas sònraichte de thoraidhean.
Aig deireadh an ìre de PCR, chan eil an lùb leudachaidh a’ nochdadh leudachadh exponential tuilleadh, agus a’ dol a-steach don ìre sreathach agus ìre àrdchlàr.
3.Reproducibility de luachan Ct
Nuair a ruigeas an cearcall PCR an àireamh cearcall de luach Ct, tha e dìreach air a dhol a-steach don fhìor ùine leudachaidh exponential.Aig an àm seo, chan eil am mearachd beag air a mheudachadh, agus mar sin tha ath-riochdachadh luach Ct sàr-mhath, is e sin, tha an aon teamplaid air a mheudachadh aig diofar amannan no ann an diofar phìoban aig an aon àm.Meudachadh, tha an luach Ct a gheibhear seasmhach.
èifeachd 1.Amplification En
Tha èifeachdas leudachaidh PCR a’ toirt iomradh air an èifeachdas leis am bi am polymerase ag atharrachadh a’ ghine gu bhith air a mheudachadh gu bhith na amplicon.Is e an èifeachdas leudachaidh nuair a thèid aon mholacile DNA atharrachadh gu dà mholacile DNA 100%.Tha èifeachdas leudachaidh gu cumanta air a chuir an cèill mar En.Gus mion-sgrùdadh artaigilean às deidh sin a dhèanamh comasach, tha na factaran a bheir buaidh air èifeachdas leudachaidh air an toirt a-steach goirid.
| Factaran a 'toirt buaidh | mìneachadh | Ciamar a breithneachadh? |
| A. Luchd-bacadh PCR | 1. Anns an teamplaid DNA tha stuthan a chuireas bacadh air freagairt PCR, leithid pròtainean no innealan-glanaidh.2. Tha an cDNA an dèidh ath-sgrìobhadh cùil a' toirt a-steach dùmhlachd àrd de theamplaid RNA no co-phàirtean reagent RT, a dh'fhaodadh bacadh a chur air freagairt PCR às dèidh sin. | 1. Co-dhiù a tha truailleadh faodar a mheas le bhith a 'tomhas a' cho-mheas de A260/A280 agus A260/A230 no RNA electrophoresis.2. Co-dhiù a tha an cDNA air a lagachadh a rèir co-mheas sònraichte às deidh tar-sgrìobhadh cùil. |
| B. Dealbhadh primer neo-iomchaidh | Chan eil primers a 'cur an cèill gu h-èifeachdach | Thoir sùil air primers airson primer-dimers no bannan-fuilt, mì-chothromachadh, agus uaireannan a’ spangachadh dealbhadh gnèitheach. |
| C. Dealbhadh prògram freagairt PCR neo-iomchaidh | 1. Chan urrainn dha primers anail a dhèanamh gu h-èifeachdach2. Sgaoileadh gu leòr de DNA polymerase 3. Lùghdaich gnìomhachd DNA polymerase àrd-teòthachd fad-ùine | 1. Tha an teòthachd annealing nas àirde na luach TM an primer2. Tha ùine ro-dhìolaidh ro ghoirid 3. Tha ùine gach ìre den mhodh-obrachaidh ath-bhualadh ro fhada |
| D. Measgachadh gu leòr de dh'ath-bheachdan no mearachdan pìobaireachd | Anns an t-siostam ath-bhualadh, tha an cruinneachadh ionadail de cho-phàirtean ath-bhualadh PCR ro àrd no neo-chòmhnard, a’ leantainn gu leudachadh neo-fhaicsinneach air leudachadh PCR | |
| E. Fad Amplicon | Tha fad an amplicon ro fhada, nas àirde na 300bp, agus tha an èifeachdas leudachaidh ìosal | Dèan cinnteach gu bheil an fhad amplicon eadar 80-300bp |
| F. Buaidh reagents qPCR | Tha an ìre de DNA polymerase anns an ath-ghnìomhach ìosal no chan eil an ìre de ionsan anns a’ bhufair air a mheudachadh, agus mar thoradh air sin chan eil gnìomhachd enzyme Taq a’ ruighinn an ìre as àirde. | Co-dhùnadh èifeachdas leudachaidh a rèir lùb àbhaisteach |
2.Range de luachan Ct
Tha luachan Ct eadar 15-35.Ma tha an luach Ct nas ìsle na 15, thathas den bheachd gu bheil an leudachadh taobh a-staigh raon na h-ùine bun-loidhne agus nach deach an stairsneach fluorescence a ruighinn.Mas fheàrr, tha dàimh sreathach eadar luach Ct agus logarithm àireamh leth-bhreac tùsail an teamplaid, is e sin, an lùb àbhaisteach.Tron lùb àbhaisteach, nuair a tha an èifeachdas leudachaidh 100%, tha an luach Ct air a thomhas airson a bhith a’ tomhas àireamh aon leth-bhreac den ghine timcheall air 35. Ma tha e nas motha na 35, tha àireamh leth-bhreac tùsail an teamplaid gu teòiridheach nas lugha na 1, a dh’ fhaodar a mheas gun bhrìgh.
Airson diofar raointean gine Ct, mar thoradh air an eadar-dhealachadh ann an àireamh leth-bhreac gine agus èifeachdas leudachaidh anns an t-suim teamplaid tùsail, feumar lùb àbhaisteach a dhèanamh airson a ’ghine agus obrachadh a-mach raon lorg sreathach a’ ghine.
3.Influencing factaran luach Ct
Bhon dàimh eadar an àireamh de chearcaill leudachaidh agus meud an toraidh: meud toraidh meudaichte = meud àireamh cearcall teamplaid tùsail × (1 + En), chìthear, fo chumhachan freagarrach, gum bi buaidh àicheil aig an ìre de theamplaid tùsail agus En air luach Ct.Bidh an eadar-dhealachadh ann an càileachd teamplaid no èifeachdas leudachaidh ag adhbhrachadh gum bi luach Ct ro mhòr no ro bheag.
Tha luach 4.Ct ro mhòr no ro bheag
Ùine puist: Feb-22-2023
