Stiùir

RNA fada gun chòdachadh, tha lncRNA na RNA neo-chòdachadh le fad nas motha na 200 nucleotides, sa chumantas eadar 200-100000 nt.Bidh lncRNA a’ riaghladh faireachdainn gine aig ìrean epigenetic, tar-sgrìobhaidh agus iar-tar-sgrìobhaidh, agus a’ gabhail pàirt ann an sàmhchair X chromosome, clò-bhualadh genome agus atharrachadh chromatin, gnìomhachd tar-sgrìobhaidh, bacadh tar-sgrìobhaidh, còmhdhail niuclasach, riaghladh cearcall cealla, riaghladh eadar-dhealachadh cealla, agus buaidhean dìolaidh dòs (buaidh dìolaidh dòs) agus mòran de phròiseasan riaghlaidh cudromach eile gu dlùth ri tachartas, leasachadh agus casg de ghalaran daonna.

01  Seòrsaichean agus feartan LncRNA

Tha lncRNA air a roinn ann an iomadh seòrsa a rèir nan diofar thùsan de chruthachadh, mar a chithear san fhigear gu h-àrd.Tha na feartan a leanas aige:

1. Tha lncRNAs mar as trice nas fhaide, le faireachdainn fiùghantach agus diofar dhòighean splicing rè eadar-dhealachaidh
2. An coimeas ri ginean còdaidh, mar as trice tha ìre faireachdainn nas ìsle aig lncRNA
3. Tha sònrachas soilleir ùineail agus spàsail aig a’ mhòr-chuid de lncRNAn ann am pròiseas eadar-dhealachaidh agus leasachadh clò
4. Tha comharran sònraichte ann am tumors agus galaran eile
5. Tha na h-ionadan subcellular aig lncRNA eadar-dhealaichte
6. Tha an t-sreath ìosal ann an glèidhteachas, ach tha ìre glèidhteachais aig a 'ghnìomh, msaa.

02 Ceistean Bitheanta mu Ath-sgrìobhadh air ais LncRNA

Air sgàth susbaint ìosal lncRNA ann an ceallan, fad fada agus structar àrd-ìre, gu tric bidh structaran iom-fhillte aig RNA leithid lùban cas no bannan fuilt, agus tha RT-qPCR buailteach do dhuilgheadasan le tar-sgrìobhadh cùil neo-shoirbheachail no èifeachdas ìosal.

03 Fuasgladh tar-sgrìobhaidh cùil LncRNA

Anns an riaghailt mheadhanach, canar tar-sgrìobhadh cùil ris a’ phròiseas de bhìorasan RNA a’ cleachdadh an transcriptase cùil aca fhèin gus DNA a cho-chur a’ cleachdadh RNA mar theamplaid.Canar tar-sgrìobhadh cùil ris a’ phròiseas airson a bhith a’ cleachdadh transcriptase air ais bhìoras RNA gus teamplaid cDNA in vitro a cho-chur.Na prìomh eileamaidean a tha air an toirt a-steach don t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil: teamplaid RNA, transcriptase cùil, primers agus co-phàirtean eile.

Teamplaid 1.RNA

Tha buaidh teamplaid RNA air tar-sgrìobhadh cùil ri fhaicinn na structar, purrachd agus ionracas.Mar as àirde purrachd agus ionracas an RNA a chaidh a thoirt a-mach, is ann as àirde a bhios èifeachdas tar-sgrìobhadh cùil agus nas cinntiche na toraidhean cainneachdail às deidh sin.Bidh an RNA a tha air a ghlanadh le ath-bheachdan às-tharraing RNA gu tric a’ toirt a-steach fuigheall alcol agus salainn guanidine, aig a bheil buaidh bacaidh làidir air a’ mhòr-chuid de transcriptase cùil.

2.Reverse transcriptase

Tha prìomh bhuaidh aig transcriptase air ais air an t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil gu lèir.Is e an teòthachd iomchaidh airson an transcriptase cùil a thathar a’ cleachdadh anns a’ mhòr-chuid de deuchainn-lannan 42 ° C sa chumantas.Gu dearbh, feumaidh fosgladh structar RNA àrd-ìre teòthachd nas àirde, agus tha na riatanasan airson an transcriptase cùil nas àirde.

3.Primer

Tha primers tar-sgrìobhaidh cùil a’ toirt a-steach primers sònraichte gine, primers air thuaiream agus primers Oligo dT.Chan eil earbaill polyA anns a’ mhòr-chuid de lncRNAn, agus tha e cudromach na primers air thuaiream a mhaidseadh gu ceart le Oligo dT.

4.Other co-phàirtean

Leis gu bheil RNA gu sònraichte furasta a lughdachadh, faodar toirt a-steach phàirtean san t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil a lughdachadh, a dh’ fhaodadh casg a chuir air inntrigeadh RNase gu h-èifeachdach agus dèanamh cinnteach à adhartas rèidh ann an tar-sgrìobhadh cùil.

Foregenefaighinn bho theamplaid RNA, ath-sgrìobhadh air ais gu qPCR

Thoir gu coileanta an lorg lncRNA agad

Ainmhidhean Iomlan RNA IsolusKit (le colbh toirt air falbh gDNA)

Cell Total RNA IsolusKit (le colbh toirt air falbh gDNA)

Lnc-RT HeroTM I (Le gDNase)(Super Premix airson synthesis cDNA ciad-sreath bho lncRNA)

Fìor-ùine PCR EasyTM-SYBR Uaine I

Abuannachdan ofàs-tharraing RNA:

Bidh an cromag a’ cleachdadh teicneòlas às-tharraing RNA an treas ginealach, gun fheum air DNase a chleachdadh.

11 mionaidean bho cheallan cultarach 96, 24, 12, agus 6-tobar, toirt a-mach àrd-èifeachdais de RNA cealla iomlan gun gDNA, fìor-ghlan, àrd-inbhe.

Buannachdan tar-sgrìobhadh cùl lncRNA:

Siostam tar-sgrìobhaidh cùil air a leasachadh gu sònraichte airson LncRNA gus truailleadh DNA genomic a thoirt air falbh gu sgiobalta.

Tha seasmhachd teirmeach àrd aig an t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil agus tha coileanadh tar-sgrìobhaidh math aige fhathast aig 50 ° C.

Faodar teamplaidean le susbaint àrd GC agus structar àrd-sgoile iom-fhillte a thionndadh air ais le àrd èifeachdas.

Buannachdanof qPCR:

Tha èifeachdas leudachaidh nas àirde aig Foregene Taq Polymerase, cugallachd leudachaidh nas àirde, agus sònrachas leudachaidh nas àirde

Tha am Real PCR Easy Mix leasaichte a’ fàgail gu bheil mothachadh lorgaidh nas àirde aig SYBR Green I, agus tha an dian fluorescence aige 3-5 tursan nas àirde na toraidhean coltach ris, a choinnicheas ri feumalachdan diofar sheòrsaichean de dheuchainnean cainneachdail fluorescence.