Bidh teicneòlas breithneachaidh moileciuil a’ cleachdadh dhòighean bith-eòlas moileciuil gus faireachdainn agus structar stuth ginteil bodhaig an duine agus diofar pathogens a lorg, gus adhbhar ro-innse agus breithneachadh ghalaran a choileanadh.

Anns na bliadhnachan mu dheireadh, le ùrachadh agus ath-aithris de theicneòlas breithneachaidh moileciuil, tha cleachdadh clionaigeach diagnosachd moileciuil air fàs nas fharsainge agus nas doimhne, agus tha a’ mhargaidh diagnosachd moileciuil air a dhol a-steach gu àm de leasachadh luath.

Tha an t-ùghdar a’ toirt geàrr-chunntas air na teicneòlasan sgrùdaidh moileciuil cumanta air a’ mhargaidh, agus tha e air a roinn ann an trì pàirtean: tha a’ chiad phàirt a’ toirt a-steach an teicneòlas PCR, tha an dàrna pàirt a’ toirt a-steach teicneòlas meudachaidh isothermal searbhag niuclasach, agus tha an dàrna pàirt a’ toirt a-steach an teicneòlas sreathachaidh.

01

Pàirt I: Teicneòlas PCR

Teicneòlas PCR

Tha PCR (freagairt slabhraidh polymerase) mar aon de na teicneòlasan leudachaidh DNA in vitro, le eachdraidh de chòrr air 30 bliadhna.

Chaidh teicneòlas PCR a thòiseachadh ann an 1983 le Kary Mullis à Cetus, na SA.Chuir Mullis a-steach airson patent PCR ann an 1985 agus dh’ fhoillsich e a’ chiad phàipear acadaimigeach PCR air Saidheans san aon bhliadhna.Bhuannaich Mullis an Duais Nobel ann an Ceimigeachd ann an 1993.

Prionnsabalan bunaiteach PCR

Faodaidh PCR mìrean DNA targaid àrdachadh còrr is millean uair.Is e am prionnsapal, fo catalysis DNA polymerase, gu bheil an dualan pàrant DNA air a chleachdadh mar theamplaid, agus thathas a’ cleachdadh primer sònraichte mar thoiseach tòiseachaidh airson leudachadh.Tha e air ath-aithris in vitro tro cheumannan leithid dì-nàdurachadh, annealing, agus leudachadh.Pròiseas DNA iallan nighean a’ cur ris an teamplaid dualan pàrant DNA.

Tha am pròiseas àbhaisteach PCR air a roinn ann an trì ceumannan:

1. Denaturation: Cleachd teòthachd àrd gus dualan dùbailte DNA a sgaradh.Tha na ceanglaichean hydrogen eadar iallan dùbailte DNA air am briseadh aig teòthachd àrd (93-98 ° C).

2. Annealing: Às deidh an DNA dà-shreath a bhith air a sgaradh, tha an teòthachd air a lughdachadh gus an urrainn don primer ceangal ris an DNA aon-shreath.

3. Leudachadh: Bidh an DNA polymerase a' tòiseachadh a' co-chur sreathan co-phàirteach air feadh nan iallan DNA bho na primers a tha air an ceangal nuair a thèid an teòthachd sìos.Nuair a bhios an leudachadh deiseil, thèid cearcall a chrìochnachadh, agus bidh an àireamh de phìosan DNA a’ dùblachadh.

Le bhith a 'toirt air ais na trì ceumannan sin 25-35 tursan, bidh an àireamh de mhìrean DNA a' dol am meud gu mòr.

Is e innleachdas PCR gum faodar diofar primers a dhealbhadh airson diofar ghinean targaid, gus an tèid na mìrean gine targaid àrdachadh ann an ùine ghoirid.

Gu ruige seo, faodar PCR a roinn ann an trì roinnean, is e sin PCR àbhaisteach, PCR cainneachdail fluorescent agus PCR didseatach.

A 'chiad ghinealach de PCR àbhaisteach

Cleachd ionnstramaid leudachaidh PCR àbhaisteach gus an gine targaid àrdachadh, agus an uairsin cleachd electrophoresis gel agarose gus an toradh a lorg, chan urrainnear ach mion-sgrùdadh càileachdail a dhèanamh.

Na prìomh eas-bhuannachdan a tha aig a 'chiad ghinealach PCR:

- buailteach do leudachadh neo-shònraichte agus toraidhean dearbhach meallta.

-Tha an lorg a’ toirt ùine mhòr agus tha an obrachadh trom.

- Chan urrainnear ach deuchainnean càileachdail a dhèanamh.

PCR cainneachdail fluorescence an dàrna ginealach

Bithear a’ cleachdadh PCR cainneachdail fluorescence (Real-Time PCR), ris an canar cuideachd qPCR, gus sùil a chumail air cruinneachadh thoraidhean meudaichte tro bhith a’ cruinneachadh chomharran flùraiseach le bhith a’ cur sgrùdairean flùraiseach a-steach a dh’ fhaodadh adhartas an t-siostam ath-bhualadh a chomharrachadh, agus gus na toraidhean a bhreithneachadh tron ​​​​lùb flùraiseach, agus faodar a thomhas le cuideachadh bho Cq.

Leis gu bheil an teicneòlas qPCR air a dhèanamh ann an siostam dùinte, tha an coltachd truailleadh air a lughdachadh, agus faodar sùil a chumail air a ’chomharra fluorescence airson lorg cainneachdail, agus mar sin is e an cleachdadh as fharsainge ann an cleachdadh clionaigeach agus tha e air a thighinn gu bhith na phrìomh theicneòlas ann am PCR.

Faodar na stuthan flùraiseach a thathas a’ cleachdadh ann am PCR cainneachdail fìor-ùine a roinn ann an: probes fluorescent TaqMan, lòchrain moileciuil agus dathan flùraiseach.

1) Deuchainn flùraiseach TaqMan:

Rè leudachadh PCR, thèid probe flùraiseach sònraichte a chur ris fhad ‘s a tha e a’ cur paidhir de primers ris.Is e oligonucleotide a th’ anns an probe, agus tha an dà cheann air an ainmeachadh fa leth le buidheann fluorescent neach-aithris agus buidheann flùraiseach quencher.

Nuair a tha an probe slàn, tha an comharra flùraiseach a bhios a’ bhuidheann luchd-aithris a’ sgaoileadh a-steach don bhuidheann quenching;rè leudachadh PCR, bidh gnìomhachd exonuclease 5 ′-3 ′ de enzyme Taq a’ sgoltadh agus a ’lughdachadh an probe, a’ toirt air an neach-aithris buidheann fluorescent agus quencher Tha a ’bhuidheann fluorescent air a sgaradh, gus am faigh an siostam sgrùdaidh fluorescence an comharra flùraiseach, is e sin, a h-uile uair a thèid dualan DNA a mheudachadh gu tur, tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur, tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur, agus tha an comharra fluorescent air a mheudachadh gu tur. le cruthachadh toradh PCR.

2) dathan flùraiseach SYBR:

Anns an t-siostam ath-bhualadh PCR, tha cus de dhath fluorescent SYBR air a chur ris.Às deidh dha dath fluorescent SYBR a bhith air a thoirt a-steach gu neo-shònraichte a-steach don dual-dùbailte DNA, bidh e a’ sgaoileadh comharra flùraiseach.Cha toir am moileciuil dath SYBR nach eil air a thoirt a-steach don t-seine comharra flùraiseach sam bith a-mach, agus mar sin a’ dèanamh cinnteach gu bheil an comharra flùraiseach Tha an àrdachadh ann am bathar PCR air a shioncronachadh gu tur leis an àrdachadh ann am bathar PCR.Chan eil SYBR a’ ceangal ach ri DNA dà-shreath, agus mar sin faodar an lùb leaghaidh a chleachdadh gus faighinn a-mach a bheil am freagairt PCR sònraichte.

3) lòchrain moileciuil

Is e probe oligonucleotide le bileag dùbailte le lùb gas a th’ ann a tha a’ cruthachadh structar falt de mu 8 bonn aig na cinn 5 agus 3.Tha na sreathan searbhag niuclasach aig gach ceann air an càradh gu co-phàirteach, ag adhbhrachadh gu bheil am buidheann flùraiseach agus a’ bhuidheann quenching teann.Dùin, cha toir e fluorescence a-mach.

Às deidh an toradh PCR a bhith air a ghineadh, tron ​​​​phròiseas annealing, tha am pàirt meadhanach den lòchran moileciuil air a chàradh le sreath DNA sònraichte, agus tha an gine flùraiseach air a sgaradh bhon ghine quencher gus fluorescence a thoirt gu buil.

Na prìomh eas-bhuannachdan aig PCR an dàrna ginealach:

Tha dìth cugallachd fhathast, agus chan eil lorg sampaill leth-bhreac neo-mhearachdach.

Tha buaidh luach cùl-fhiosrachaidh ann, agus tha an toradh buailteach do bhriseadh.

PCR didseatach treas ginealach

Bidh PCR didseatach (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) a’ tomhas àireamh leth-bhreac an t-sreath targaid tro lorg puing crìochnachaidh, agus is urrainn dhaibh lorg cainneachdail iomlan a dhèanamh gun a bhith a’ cleachdadh smachdan a-staigh agus lùban àbhaisteach.

Bidh PCR didseatach a’ cleachdadh lorg puing crìochnachaidh agus chan eil e an urra ri luach Ct (stairsneach cearcall), agus mar sin chan eil an èifeachdas leudachaidh nas lugha de bhuaidh air an ath-bhualadh PCR didseatach, agus tha an fhulangas do luchd-bacadh ath-bhualadh PCR air a leasachadh, le fìor chruinneas agus ath-riochdachadh.

Air sgàth feartan cugallachd àrd agus mionaideachd àrd, chan eil e furasta a chuir bacadh air luchd-bacadh ath-bhualadh PCR, agus faodaidh e fìor àireamhachadh iomlan a choileanadh às aonais toraidhean àbhaisteach, a tha air a thighinn gu bhith na phrìomh àite sgrùdaidh is tagraidh.

A rèir nan diofar chruthan den aonad freagairt, faodar a roinn ann an trì seòrsaichean: siostaman microfluidic, chip agus droplet.