Tha mi a 'creidsinn gum bi a h-uile duine an-còmhnaidh a' tighinn tarsainn air duilgheadasan mar sin nuair a bhios iad a 'dèanamh ath-bheachdan PCR, ach faodar a' mhòr-chuid dhiubh a roinn ann an dà phrìomh dhuilgheadas:

Ro bheag de leudachadh air an teamplaid gine (amplification);
Cus leudachadh gine neo-targaid.
Is e cleachdadh stuthan cur-ris aon de na ro-innleachdan cumanta airson na duilgheadasan sin fhuasgladh.Mar as trice tha dà thaobh aig dreuchd cur-ris:
structar àrd-sgoilede ghinean (àrd-structar);
Lùghdaich priming neo-shònraichte.
An-diugh, bheir an neach-deasachaidh cunntas goirid dhut mu na stuthan cur-ris cumanta ann an ath-bheachdan PCR agus na gnìomhan aca.
Cur-ris a lùghdaicheas structar àrd-sgoile
sulfoxide(DMSO)
sampallan ginele susbaint àrd GC.Ach, tha DMSO cuideachd a 'lùghdachadh gnìomhachd Taq polymerase gu mòr.Mar sin, feumaidh a h-uile duine cothromachadh a dhèanamh air ruigsinneachd teamplaid agus gnìomhachd an polymerase.Tha an neach-deasachaidh a’ moladh gun urrainn dhut diofar cho-chruinneachaidhean DSMO fheuchainn, leithid bho 2% gu 10%, gus an dùmhlachd a lorg a fhreagras air an deuchainn agad.
Glanadairean neo-ianach
Mar as trice bidh innealan-glanaidh neo-ionic, leithid 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 no NP-40, a 'lùghdachadh structar àrd-sgoile DNA.Ged a dh’ fhaodadh seo leudachadh gine teamplaid a mheudachadh, bidh e cuideachd ag adhbhrachadh trioblaid leudachaidh neo-shònraichte.Mar sin, bidh na stuthan cur-ris sin ag obair gu math airson ath-bheachdan PCR le toradh ìosal às aonais sprùilleach, ach chan eil iad cho math airson ath-bheachdan PRC a tha an ìre mhath neo-ghlan.Is e buannachd eile de luchd-glanaidh neo-ianach lughdachadh truailleadh SDS.Mar as trice tron ​​​​phròiseas às-tharraing DNA, thèid SDS a thoirt chun cheum PCR, a tha gu mòr a ’cur bacadh air gnìomhachd a’ polymerase.Mar sin, le bhith a’ cur 0.5% Tween-20 no Tween-40 ris an ath-bhualadh faodaidh sin droch bhuaidhean SDS a neodachadh.
Betaine_
Faodaidh Betaine leudachadh DNA a leasachadh le bhith a’ lughdachadh cruthachadh structair àrd-sgoile agus sa chumantas tha e na chur-ris “dìomhair” ri innealan PCR malairteach.Ma tha thu airson betaine a chleachdadh, bu chòir dhut betaine no betaine mono-hydrate (Betaine no Betaine mono-hydrate), ach chan e betaine hydrochloride (Betaine HCl), atharraich gu dùmhlachd deireannach de 1-1.7M.Faodaidh Betaine cuideachd cuideachadh le bhith a ’leasachadh sònrachas oir tha e a’ cur às don eisimeileachd co-dhèanamh paidhir bunaiteach de leaghadh DNA / dì-nàdarachadh DNA.
Cur-ris gus priming neo-shònraichte a lughdachadh
Formamide
Tha Formamide na chur-ris PCR organach a thathas a’ cleachdadh gu cumanta.Faodaidh e a dhol còmhla ri clais mhòr agus groove beag ann an DNA, mar sin a’ lughdachadh seasmhachd prìomh helix DNA dùbailte agus a’ lughdachadh teòthachd leaghaidh DNA.Mar as trice tha an dùmhlachd de formamide a thathar a’ cleachdadh ann an deuchainnean PCR 1% -5%.
Tetramethylammonium chloride( TMAC)
Faodaidh cloride tetramethylammonium àrdachadh a dhèanamh air sònrachas tar-chuiridh (sònrachas tar-chuiridh) agus teòthachd leaghaidh DNA àrdachadh.Mar sin, faodaidh TMAC prìomhachas neo-shònraichte a thoirt air falbh agus lughdachadh mì-cheangail DNA agus RNA.Ma chleachdas tuprimers crìonadhanns an ath-bhualadh PCR , cuimhnich gun cuir thu TMAC ris, a tha gu cumanta air a chleachdadh aig dùmhlachd 15-100mM.
Cur-ris cumanta eile
A bharrachd air an dà sheòrsa cur-ris a chaidh ainmeachadh gu h-àrd, tha mòran cur-ris cumanta ann an ath-bheachdan PCR, ged a tha gnìomhan eadar-dhealaichte aca, tha iad cuideachd glè chudromach.
ian magnesium
Tha ion magnesium na chofactor riatanach (cofactor) de polymerase, is e sin ri ràdh, às aonais ion magnesium, tha polymerase neo-ghnìomhach.Ach, faodaidh cus ianan magnesium buaidh a thoirt air èifeachdas polymerase.Bidh an ìre de ianan magnesium anns gach freagairt PCR eadar-dhealaichte.Bidh riochdairean meallta (leithid EDTA no citrate), dùmhlachd dNTPs agus pròtanan uile a’ toirt buaidh air dùmhlachd ions magnesium.Mar sin, ma tha duilgheadasan agad leis an deuchainn PCR agad, faodaidh tu feuchainn ri diofar chruinneachaidhean ian magnesium atharrachadh, mar eisimpleir, bho 1.0 gu 4.0mM, le eadar-ama de 0.5–1mM eatarra.
Is fhiach a bhith mothachail gum faod grunn chuairtean reothadh-leaghadh leantainn gu sreathadh dùmhlachd de fhuasgladh magnesium chloride.Mar sin, feumaidh tu a sgaoileadh gu tur ro gach cleachdadh, agus measgachadh gu math mus cleachd thu e.
Clàr serum bovine(Albumin bò, BSA)
Ann an deuchainnean ceimigeachd moileciuil, tha serum albumin bovine na chur-ris gu math cumanta, gu sònraichte ann an cnàmhadh enzyme cuibhreachaidh agus deuchainnean PCR.Ann an ath-bheachdan PCR, tha BSA cuideachail ann a bhith a’ lughdachadh truailleadh leithid todhar phenolic.Agus thathar ag ràdh cuideachd gun urrainn dha lùghdachadh a dhèanamh air gèilleadh reactants ri balla an tiùba deuchainn.Anns an ath-bhualadh PCR, mar as trice faodaidh an ìre de BSA a chaidh a chur ris ruighinn 0.8 mg / ml.
 
Bathar co-cheangailte:
Gaisgeach PCR(le dath)
Gaisgeach PCR