• Tha PCR na dhòigh air a chleachdadh gus DNA àrdachadh bho ìre bheag de theamplaid DNA.Bidh RT-PCR a’ cleachdadh tar-sgrìobhadh cùil gus teamplaid DNA a thoirt gu buil bho stòr RNA a ghabhas leudachadh an uairsin.
• Mar as trice tha PCR agus RT-PCR mar ath-bheachdan crìochnachaidh, fhad ‘s a bhios qPCR agus RT-qPCR a’ cleachdadh cinneasachadh ìre synthesis toraidh rè freagairt PCR gus tomhas a dhèanamh air an ìre de theamplaid a tha an làthair.
• Bidh modhan nas ùire, leithid PCR didseatach, a’ toirt seachad tomhas iomlan den teamplaid DNA tùsail, fhad ‘s a tha dòighean leithid PCR isothermal a’ lughdachadh an fheum air uidheamachd daor gus toraidhean earbsach a thoirt seachad.

Tha freagairt slabhraidh polymerase (PCR) na dhòigh bith-eòlas moileciuil gu ìre mhath sìmplidh agus air a chleachdadh gu farsaing gus sreathan DNA agus RNA a mheudachadh agus a lorg.An coimeas ri dòighean traidiseanta airson clonadh DNA agus leudachadh, a dh’ fhaodadh làithean a ghabhail gu tric, chan fheum PCR ach beagan uairean a thìde.Tha PCR gu math mothachail agus feumach air glè bheag de theamplaid airson lorg agus leudachadh air sreathan sònraichte.Tha modhan bunaiteach PCR air a dhol air adhart nas fhaide bho lorg sìmplidh DNA agus RNA.Gu h-ìosal, tha sinn air sealladh farsaing a thoirt seachad air na diofar dhòighean PCR agus na h-ath-bheachdan a bheir sinn seachad aig Enzo Life Sciences airson na feumalachdan rannsachaidh agad.Tha sinn ag amas air luchd-saidheans a chuideachadh gu luath gus faighinn gu ath-bheachdan PCR airson an cleachdadh san ath phròiseact rannsachaidh aca!

PCR

Airson PCR àbhaisteach, chan eil agad ach DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, an teamplaid DNA ri leudachadh, agus teirm-cuaireadair.Tha an uidheamachd PCR cho sìmplidh ris an adhbhar aige: 1) tha DNA dà-shreath (dsDNA) air a dhì-nàdarachadh le teas, 2) primers a ’co-thaobhadh ris na sreathan DNA singilte, agus 3) tha na primers air an leudachadh le DNA polymerase, a’ leantainn gu dà leth-bhreac den DNA tùsail.Canar aon chearcall leudachaidh (Fig. 1) ris a’ phròiseas dì-nàdurachaidh, annealing, agus leudachadh thairis air sreath de theodhachd is amannan.

Bu chòir gach ceum den chearcall a bhith air a mheudachadh airson an teamplaid agus an seata primer a thathar a’ cleachdadh.Bidh an cearcall seo air ath-aithris timcheall air 20-40 uair, agus faodar an toradh leudaichte an uairsin a sgrùdadh, mar as trice le gel agarose (Fig. 2).

Leis gu bheil PCR na dhòigh air leth mothachail agus gu bheil feum air meudan glè bheag airson ath-bheachdan singilte, thathas a’ moladh prìomh mheasgachadh ullachadh airson grunn ath-bheachdan.Feumaidh am prìomh mheasgachadh a bhith air a mheasgachadh gu math agus an uairsin air a roinn leis an àireamh de ath-bheachdan, a’ dèanamh cinnteach gum bi an aon uiread de enzyme, dNTPs, agus primers anns gach freagairt.Bidh mòran de sholaraichean, leithid Enzo Life Sciences, cuideachd a’ tabhann measgachadh PCR anns a bheil a h-uile càil mu thràth ach a-mhàin primers agus an teamplaid DNA.

Tha roinnean làn Guanine / Cytosine (beairteach GC) a’ riochdachadh dùbhlan ann an dòighean àbhaisteach PCR.Tha sreathan làn GC nas seasmhaiche na sreathan le susbaint GC nas ìsle.A bharrachd air an sin, tha sreathan làn GC buailteach a bhith a’ cruthachadh structaran àrd-sgoile, leithid lùban fuilt.Mar thoradh air an sin, tha e duilich dualan dùbailte làn GC a sgaradh gu tur aig ìre dì-nàdarachaidh.Mar thoradh air an sin, chan urrainn dha DNA polymerase an dualan ùr a cho-chur gun bhacadh.Faodaidh teòthachd dì-nàdurachaidh nas àirde seo a leasachadh, agus faodaidh atharrachaidhean a dh’ ionnsaigh teòthachd analachaidh nas àirde agus ùine analachaidh nas giorra casg a chuir air ceangal neo-shònraichte de phrìomhairean làn GC.Faodaidh ath-bheachdan a bharrachd cur ri leudachadh sreathan làn GC.Bidh DMSO, glycerol, agus betaine a’ cuideachadh le bhith a’ cur dragh air na structaran àrd-sgoile a tha air adhbhrachadh le eadar-obrachadh GC agus mar sin a’ comasachadh sgaradh nan dualan dùbailte.

Hot Start PCR

Tha leudachadh neo-shònraichte na dhuilgheadas a dh’ fhaodadh tachairt aig àm PCR.Bidh a’ mhòr-chuid de polymerases DNA a thathas a’ cleachdadh airson PCR ag obair as fheàrr aig teòthachd timcheall air 68 ° C gu 72 ° C.Faodaidh an enzyme, ge-tà, a bhith gnìomhach aig teòthachd nas ìsle, ged a tha e gu ìre nas ìsle.Aig teòthachd fada nas ìsle na an teòthachd annealing, faodaidh primers ceangal gu neo-shònraichte agus leantainn gu leudachadh neo-shònraichte, eadhon ged a thèid am freagairt a stèidheachadh air deigh.Faodar seo a chasg le bhith a’ cleachdadh luchd-bacadh polymerase a bhios a’ dealachadh ris an DNA polymerase dìreach aon uair ‘s gun ruigear teòthachd sònraichte, agus mar sin is e am facal tòiseachaidh teth PCR.Faodaidh an neach-dìon a bhith na antibody a bhios a ’ceangal a’ polymerase agus denatures aig a ’chiad teòthachd dì-nàdurrach (95 ° C mar as trice).

Àrd Fidelity Polymerase

Fhad ‘s a bhios DNA polymerases ag àrdachadh gu cothromach ris an t-sreath teamplaid tùsail, faodaidh mearachdan ann an maidseadh nucleotide tachairt.Faodaidh mì-chothromachadh ann an tagraidhean leithid clonadh tar-sgrìobhaidhean cuibhrichte adhbhrachadh, agus pròtainean mì-eadar-theangachadh no neo-ghnìomhach sìos an abhainn.Gus na mì-chothromachadh sin a sheachnadh, chaidh polymerases le gnìomhachd “leughadh dearbhaidh” a chomharrachadh agus a thoirt a-steach don t-sruth-obrach.Chaidh a 'chiad polymerase dearbhaidh, Pfu, a chomharrachadh ann an 1991 ann am Pyrococcus furiosus.Tha gnìomhachd exonuclease 3 'gu 5' aig an einnsein Pfu seo.Mar a tha an DNA air a mheudachadh, bidh an exonuclease a’ toirt air falbh nucleotides mì-chothromach aig ceann 3’ an iallan.An uairsin thèid an nucleotide ceart a chuir na àite, agus tha synthesis DNA a’ leantainn.Tha comharrachadh sreathan nucleotide ceàrr stèidhichte air an dàimh ceangail airson an triphosphate nucleoside ceart leis an enzyme, far a bheil ceangal neo-èifeachdach a’ slaodadh an synthesis agus a’ ceadachadh ath-chur ceart.Tha gnìomhachd dearbhaidh Pfu polymerase a’ leantainn gu nas lugha de mhearachdan san t-sreath mu dheireadh an taca ri Taq DNA polymerase.Anns na bliadhnachan mu dheireadh, chaidh enzyman dearbhaidh eile a chomharrachadh, agus chaidh atharrachaidhean a dhèanamh air an enzyme Pfu tùsail gus an ìre mearachd a lughdachadh tuilleadh rè leudachadh DNA.

RT-PCR

Tha tar-sgrìobhadh cùil PCR, no RT-PCR, a’ ceadachadh RNA a chleachdadh mar theamplaid.Tha ceum a bharrachd a’ ceadachadh RNA a lorg agus a leudachadh.Tha an RNA air ath-sgrìobhadh gu cùl gu DNA co-phàirteach (cDNA), a’ cleachdadh transcriptase cùil.Tha càileachd agus purrachd an teamplaid RNA deatamach airson soirbheachas RT-PCR.Is e a’ chiad cheum de RT-PCR synthesis de hybrid DNA/RNA.Tha gnìomh RNase H aig Reverse transcriptase cuideachd, a tha a’ lughdachadh cuibhreann RNA den hybrid.Tha am moileciuil DNA aon-shreath an uairsin air a chrìochnachadh le gnìomhachd DNA polymerase an urra ri DNA den transcriptase cùil gu cDNA.Faodaidh èifeachdas ath-bhualadh a’ chiad dual buaidh a thoirt air a’ phròiseas leudachaidh.Às an seo, tha am modh àbhaisteach PCR air a chleachdadh gus an cDNA a mheudachadh.Tha mòran bhuannachdan aig comas RNA a thoirt air ais gu cDNA le RT-PCR, agus tha e air a chleachdadh gu sònraichte airson mion-sgrùdadh abairt gine.Tha RNA aon-shreath agus gu math neo-sheasmhach, a tha ga dhèanamh dùbhlanach a bhith ag obair leis.Mar as trice bidh e na chiad cheum ann an qPCR, a bhios a’ tomhas tar-sgrìobhaidhean RNA ann an sampall bith-eòlasach.

qPCR agus RT-qPCR

Tha PCR cainneachdail (qPCR) air a chleachdadh gus searbhagan niuclasach a lorg, a chomharrachadh agus a thomhas airson grunn thagraidhean.Ann an RT-qPCR, bidh tar-sgrìobhaidhean RNA gu tric air an tomhas le bhith gan ath-sgrìobhadh gu cDNA an toiseach, mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd, agus an uairsin thèid qPCR a dhèanamh às deidh sin.Mar a tha ann am PCR àbhaisteach, tha DNA air a mheudachadh le trì ceumannan ath-aithris: dì-nàdurachadh, annealing, agus leudachadh.Ach, ann an qPCR, tha bileagan flùraiseach a’ comasachadh dàta a chruinneachadh mar a thèid PCR air adhart.Tha mòran bhuannachdan aig an dòigh seo air sgàth an raon de dhòighean-obrach agus ceimigeachd a tha rim faighinn.

Ann an qPCR stèidhichte air dath (uaine mar as trice), tha bileagan flùraiseach a’ ceadachadh tomhas de na moileciuilean DNA meudaichte le bhith a’ cleachdadh dath ceangail dsDNA.Rè gach cearcall, thèid an fluorescence a thomhas.Bidh an comharra fluorescence ag àrdachadh a rèir na tha de DNA ath-riochdachadh.Mar sin, tha an DNA air a thomhas ann an “fìor-ùine” (Fig. 3).Is e na h-eas-bhuannachdan a thaobh qPCR stèidhichte air dath nach gabh ach aon targaid a sgrùdadh aig aon àm agus gum bi an dath a’ ceangal ri ds-DNA sam bith a tha san t-sampall.

Ann an qPCR stèidhichte air probe, faodar mòran thargaidean a lorg aig an aon àm anns gach sampall, ach tha feum air optimization agus dealbhadh de sgrùdadh (ean) targaid sònraichte a thèid a chleachdadh a bharrachd air primers.Tha grunn sheòrsaichean de dhealbhaidhean probe rim faighinn, ach is e an seòrsa as cumanta probe hydrolysis, a tha a’ toirt a-steach fluorophore agus quencher.Bidh gluasad lùth ath-shuidheachadh fluorescence (FRET) a’ cur casg air sgaoileadh an fluorophore tron ​​​​t-seisean fhad ‘s a tha an probe slàn.Ach, rè ath-bhualadh PCR, tha an probe air a h-uisgeachadh rè leudachadh primer agus leudachadh air an t-sreath shònraichte a tha e ceangailte.Tha sgoltadh an probe a 'sgaradh an fluorophore bhon quencher agus a' leantainn gu àrdachadh ann an flùrasachadh a tha an urra ri leudachadh (Fig. 4).Mar sin, tha an comharra flùraiseach bho fhreagairt qPCR stèidhichte air probe ann an co-rèir ris an ìre de shreath targaid probe a tha an làthair san sampall.Leis gu bheil qPCR stèidhichte air probe nas mionaidiche na qPCR stèidhichte air dath, is e gu tric an teicneòlas a thathar a’ cleachdadh ann am measaidhean breithneachaidh stèidhichte air qPCR.

Meudachadh Isothermal

Tha na dòighean PCR air an deach iomradh a thoirt gu h-àrd a’ feumachdainn uidheamachd thermocycling daor gus rampadh ceart a dhèanamh air teòthachd an t-seòmair suas is sìos airson na ceumannan dì-nàdurrach, annealing agus leudachaidh.Chaidh grunn dhòighean a leasachadh nach eil feumach air innealan cho mionaideach agus faodar an coileanadh ann an amar uisge sìmplidh no eadhon taobh a-staigh ceallan ùidh.Canar leudachadh isothermal ris na dòighean sin còmhla agus obair stèidhichte air leudachadh eas-chruthach, sreathach no cascade.

Is e an seòrsa leudachaidh isothermal as ainmeile leudachadh isothermal le meadhan lùb, no LAMP.Bidh LAMP a’ cleachdadh leudachadh exponential aig 65⁰C gus teamplaid DNA no RNA a mheudachadh.Nuair a bhios tu a’ coileanadh LAMP, thathas a’ cleachdadh ceithir gu sia primers a tha a’ cur ri roinnean den DNA targaid le DNA polymerase gus DNA ùr a cho-chur.Tha sreathan molaidh aig dhà de na primers sin a dh’ aithnicheas sreathan anns na primers eile agus a cheanglas iad, a’ leigeil le structar “lùb” a bhith a’ cruthachadh anns an DNA a tha air ùr-shìneadh a bhios an uairsin a’ cuideachadh le bhith a’ comharrachadh primer ann an cuairtean leudachaidh às deidh sin.Faodar LAMP a dhealbhadh le grunn dhòighean, a’ gabhail a-steach fluorescence, electrophoresis gel agarose, no colorimetry.Leis cho furasta ‘s a bha e a bhith a’ faicinn agus a ’lorg làthaireachd no neo-làthaireachd toraidh a rèir dath-tomhais agus dìth uidheamachd daor a bha a dhìth bha LAMP na roghainn iomchaidh airson deuchainn SARS-CoV-2 ann an raointean far nach robh deuchainnean deuchainn-lann clionaigeach rim faighinn gu furasta, no stòradh agus giùlan sampaill. cha robh e ion-dhèanta, no ann an deuchainn-lannan aig nach robh uidheamachd teirmeach-chuairteachaidh PCR roimhe.