Stuth tòiseachaidh: RNA

Tha tar-sgrìobhadh cùil cainneachdail PCR (RT-qPCR) na dhòigh deuchainneach air a chleachdadh ann an deuchainnean PCR a’ cleachdadh RNA mar an stuth tòiseachaidh.San dòigh seo, tha RNA iomlan no RNA teachdaire (mRNA) air ath-sgrìobhadh an toiseach gu DNA co-phàirteach (cDNA) le transcriptase air ais.Às deidh sin, chaidh freagairt qPCR a dhèanamh a’ cleachdadh an cDNA mar theamplaid.Chaidh RT-qPCR a chleachdadh ann an grunn thagraidhean bith-eòlas moileciuil, a’ gabhail a-steach mion-sgrùdadh abairt gine, dearbhadh eadar-theachd RNA, dearbhadh microarray, lorg pathogen, deuchainn ginteil, agus sgrùdadh galair.

Modhan aon-cheum agus dà-cheum airson RT-qPCR

Faodar RT-qPCR a choileanadh le modh aon-cheum no dà cheum.Bidh RT-qPCR aon-cheum a’ cothlamadh tar-sgrìobhadh cùil agus leudachadh PCR, a’ leigeil le transcriptase cùil agus DNA polymerase an ath-bhualadh a chrìochnachadh san aon phìob fo na h-aon chumhachan bufair.Chan fheum RT-qPCR aon-cheum ach cleachdadh primers sreath-sònraichte.Ann an RT-qPCR dà-cheum, bidh tar-sgrìobhadh cùil agus leudachadh PCR air an coileanadh ann an dà phìob, a’ cleachdadh diofar bufairean làn-leasaichte, suidheachaidhean freagairt, agus ro-innleachdan dealbhaidh primer.

Bathar co-cheangailte:

RT-qPCR Easy (One Step) -SYBR Uaine I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step) - Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix Airson Synthesis CDNA First-Strand

Fìor-ùine PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Fìor-ùine PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Taghadh de RNA iomlan agus mRNA

Nuair a bhios tu a’ dealbhadh deuchainn RT-qPCR, tha e cudromach co-dhùnadh am bu chòir dhut RNA iomlan no mRNA fìor-ghlan a chleachdadh mar theamplaid airson tar-sgrìobhadh air ais.Ged a dh’ fhaodadh mRNA cugallachd beagan nas àirde a thoirt seachad, tha RNA iomlan fhathast air a chleachdadh gu tric.Is e an adhbhar airson seo gu bheil buannachd nas cudromaiche aig RNA iomlan mar stuth tòiseachaidh na mRNA.An toiseach, feumaidh am pròiseas nas lugha de cheumannan glanaidh, a nì cinnteach gum bi an teamplaid air ais gu cainneachdail nas fheàrr agus gum bi toraidhean àbhaisteach nas fheàrr gu àireamhan cealla tòiseachaidh.San dàrna h-àite, bidh e a’ seachnadh ceum beairteachaidh mRNA, a dh’ fhaodadh a bhith comasach air toraidhean skewed a sheachnadh mar thoradh air faighinn seachad air diofar mRNAn.Gu h-iomlan, leis gu bheil tomhas coimeasach den ghine targaid nas cudromaiche na làn chugallachd an lorg anns a’ mhòr-chuid de thagraidhean, tha RNA iomlan nas freagarraiche sa mhòr-chuid de chùisean.

Reverse tar-sgrìobhadh primer

Anns an dòigh dà-cheum, faodar trì dòighean eadar-dhealaichte a chleachdadh gus freagairt cDNA a phrìomhadh: primers oligo (dT), primers air thuaiream, no primers sreath-sònraichte.Mar as trice, bidh primers oligo (dT) agus primers air thuaiream air an cleachdadh còmhla.Bidh na primers sin a’ ceangal ri dualan teamplaid mRNA agus a’ toirt seachad transcriptase air ais le àite tòiseachaidh airson synthesis.

Tar-sgrìobhadh air ais

Tha Reverse transcriptase na enzyme a bhios a’ cleachdadh RNA gus DNA a cho-chur.Tha gnìomhachd RNase aig cuid de na tar-sgrìobhaidhean cùil agus faodaidh iad sreathan RNA a lughdachadh ann an iallan tar-chinealach RNA-DNA às deidh an tar-sgrìobhadh.Mura h-eil gnìomhachd enzymatic RNase aige, faodar RNaseH a chuir ris airson èifeachdas qPCR nas àirde.Tha enzyman a chleachdar gu cumanta a’ toirt a-steach Moloney murine leucemia bhìoras reverse transcriptase agus eun myeloblastoma bhìoras reverse transcriptase.Airson RT-qPCR, tha e air leth freagarrach transcriptase cùil a thaghadh le teirm-sheasmhachd nas àirde, gus an urrainnear cDNA synthesis a dhèanamh aig teòthachd nas àirde, a’ dèanamh cinnteach gu bheil tar-sgrìobhadh soirbheachail de RNAn le structar àrd-sgoile nas àirde, fhad ‘s a chumas iad an làn ghnìomhachd tron ​​​​ath-bhualadh, a’ leantainn gu toradh cDNA nas àirde.

Bathar co-cheangailte:

Ath-sgrìobhadh cùl M-MLV Foreasy

Gnìomhachd RNase H de transcriptase cùil

Tha RNaseH comasach air iallan RNA a lughdachadh bho duplexes RNA-DNA, a’ ceadachadh synthesis èifeachdach de DNA dà-shreath.Ach, nuair a bhios tu a’ cleachdadh mRNA fada mar theamplaid, dh’ fhaodadh an RNA a bhith air a lughdachadh ro-ùine, a’ leantainn gu cDNA truncated.Mar sin, tha e gu tric buannachdail gnìomhachd RNaseH a lughdachadh aig àm clonadh cDNA ma thathar ag iarraidh tar-sgrìobhaidhean fada.An coimeas ri sin, tha tar-sgrìobhaidhean cùil le gnìomhachd RNase H gu tric buannachdail airson tagraidhean qPCR oir bidh iad a’ neartachadh leaghadh duplexes RNA-DNA anns a ’chiad chearcall de PCR.

Dealbhadh primer

Bu chòir primers PCR a thathar a’ cleachdadh airson a’ cheum qPCR ann an RT-qPCR a bhith air an dealbhadh gus a bhith a’ dol thairis air snaim exon-exon, far am faodadh primer leudachaidh a dhol thairis air fìor chrìoch exon-intron.Leis nach eil sreathan DNA genomic anns a bheil intron air an leudachadh, tha an dealbhadh seo a’ lughdachadh a’ chunnart gum bi nithean meallta air an leudachadh bho bhith a’ truailleadh DNA genomic.

Mura h-urrainnear primers a dhealbhadh gus crìochan exons no exon-exon a sgaradh, is dòcha gum feumar sampallan RNA a làimhseachadh le DNase I gun RNase no dsDNase gus truailleadh DNA genomic a thoirt air falbh.

Smachd RT-qPCR

Bu chòir smachd àicheil tar-sgrìobhaidh cùil (-RT smachd) a bhith air a ghabhail a-steach anns a h-uile deuchainn RT-qPCR gus truailleadh DNA a lorg (leithid toraidhean genomic DNA no PCR bho ath-bheachdan roimhe).Anns an smachd seo tha a h-uile pàirt freagairt ach a-mhàin transcriptase cùil.Leis nach eil tar-sgrìobhadh air ais a’ tachairt leis an smachd seo, ma choimheadas tu air leudachadh PCR, tha e nas coltaiche gun tèid truailleadh bho DNA a dhèanamh.