Stuth tòiseachaidh: RNA

Tha tar-sgrìobhadh cùil cainneachdail PCR (RT-qPCR) na dhòigh deuchainneach air a chleachdadh ann an deuchainnean PCR a’ cleachdadh RNA mar an stuth tòiseachaidh.San dòigh seo, tha RNA iomlan no RNA teachdaire (mRNA) air ath-sgrìobhadh an toiseach gu DNA co-phàirteach (cDNA) le transcriptase cùil.Às deidh sin, chaidh freagairt qPCR a dhèanamh a’ cleachdadh an cDNA mar theamplaid.Chaidh RT-qPCR a chleachdadh ann an grunn thagraidhean bith-eòlas moileciuil, a’ gabhail a-steach mion-sgrùdadh abairt gine, dearbhadh eadar-theachd RNA, dearbhadh microarray, lorg pathogen, deuchainn ginteil, agus sgrùdadh galair.

Modhan aon-cheum agus dà-cheum airson RT-qPCR

Faodar RT-qPCR a choileanadh le modh aon-cheum no dà cheum.Bidh RT-qPCR aon-cheum a’ cothlamadh tar-sgrìobhadh cùil agus leudachadh PCR, a’ leigeil le transcriptase cùil agus DNA polymerase an ath-bhualadh a chrìochnachadh san aon phìob fo na h-aon chumhachan bufair.Chan fheum RT-qPCR aon-cheum ach cleachdadh primers sreath-sònraichte.Ann an RT-qPCR dà-cheum, bidh tar-sgrìobhadh cùil agus leudachadh PCR air an coileanadh ann an dà phìob, a’ cleachdadh diofar bufairean làn-leasaichte, suidheachaidhean freagairt, agus ro-innleachdan dealbhaidh primer.

artaigil1

 

Buannachd

Eas-bhuannachd

Aon Cheum Tha nas lugha de mhearachd deuchainneach aig an dòigh seo leis gu bheil an dà ath-bhualadh air an dèanamh ann an aon phìob

 

Bidh nas lugha de cheumannan pìobaireachd a’ lughdachadh cunnart truailleadh

 

Freagarrach airson leudachadh / sgrìonadh àrd-thoradh, luath agus ath-riochdachadh

Chan urrainnear ath-bheachdan dà-cheum a mheudachadh air leth

 

Leis gu bheil na suidheachaidhean freagairt air an cuir an cunnart le bhith a’ cothlamadh an ath-bhualadh dà-cheum, chan eil an cugallachd cho math ris an dòigh dà-cheum.

 

Tha an àireamh de thargaidean a lorgar le aon shampall beag

Dà Cheum Comas leabharlannan cDNA seasmhach a chruthachadh a ghabhas an stòradh airson ùine mhòr agus a chleachdadh ann an ioma ath-bheachdan

 

Faodar ginean targaid agus ginean iomraidh a mheudachadh bhon aon leabharlann cDNA gun fheum air iomadh leabharlann cDNA

 

Bufairean ath-bhualadh agus suidheachaidhean freagairt a bheir comas do ruith ath-bhualadh singilte a mheudachadh

 

Taghadh sùbailte de shuidheachaidhean brosnachaidh

Le bhith a’ cleachdadh grunn phìoban, agus barrachd cheumannan pìobaireachd tha sin a’ meudachadh chunnart truailleadh DNA,

agus a’ caitheamh ùine.

 

Tha feum air barrachd optimization na an dòigh aon-cheum

Bathar co-cheangailte:

RT-qPCR Easy (One Step) -SYBR Uaine I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step) - Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix Airson Synthesis CDNA First-Strand

Fìor-ùine PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Fìor-ùine PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Taghadh de RNA iomlan agus mRNA

Nuair a bhios tu a’ dealbhadh deuchainn RT-qPCR, tha e cudromach co-dhùnadh am bu chòir dhut RNA iomlan no mRNA fìor-ghlan a chleachdadh mar theamplaid airson tar-sgrìobhadh air ais.Ged a dh’ fhaodadh mRNA cugallachd beagan nas àirde a thoirt seachad, tha RNA iomlan fhathast air a chleachdadh gu tric.Is e an adhbhar airson seo gu bheil buannachd nas cudromaiche aig RNA iomlan mar stuth tòiseachaidh na mRNA.An toiseach, feumaidh am pròiseas nas lugha de cheumannan glanaidh, a nì cinnteach gum bi an teamplaid air ais gu cainneachdail nas fheàrr agus gum bi toraidhean àbhaisteach nas fheàrr gu àireamhan cealla tòiseachaidh.San dàrna h-àite, bidh e a’ seachnadh ceum beairteas mRNA, a dh’ fhaodadh a bhith comasach air toraidhean skewed a sheachnadh mar thoradh air faighinn seachad air diofar mRNAn.Gu h-iomlan, leis gu bheil tomhas coimeasach den ghine targaid nas cudromaiche na làn chugallachd an lorg anns a’ mhòr-chuid de thagraidhean, tha RNA iomlan nas freagarraiche sa mhòr-chuid de chùisean.

Reverse tar-sgrìobhadh primer

Anns an dòigh dà-cheum, faodar trì dòighean eadar-dhealaichte a chleachdadh gus freagairt cDNA a phrìomhadh: primers oligo (dT), primers air thuaiream, no primers sreath-sònraichte.Mar as trice, bidh primers oligo (dT) agus primers air thuaiream air an cleachdadh còmhla.Bidh na primers sin a’ ceangal ri dualan teamplaid mRNA agus a’ toirt seachad transcriptase air ais le àite tòiseachaidh airson synthesis.

artaigil2

Taghadh primer Structar agus gnìomh Buannachd Eas-bhuannachd
Oligo (dT) primer (no primer oligo (dT) acair) Annealing leudaichte gu fuigheall thymine aig earball poly(A) mRNA;tha primer acair oligo (dT) a’ toirt a-steach G, C, no A aig ceann 3 ′ (làrach acair) Synthesis de cDNA làn-fhaid bho mRNA poly(A)-tailed

 

Freagarrach nuair a tha nas lugha de stuth tòiseachaidh ri fhaighinn

 

Bidh làrach acair a’ dèanamh cinnteach gu bheil am primer oligo(dT) a’ ceangal ri earball 5 ′ poly(A) den mRNA

Freagarrach a-mhàin airson a bhith ag àrdachadh ghinean le earbaill poly(A).

 

Faigh cDNA air a ghearradh bhon làrach priming * 2 ann am poly(A)

 

Claonadh a cheangal ris a’ cheann 3 ′ *

 

* Tha an comas seo air a lughdachadh ma thèid primers oligo (dT) acair a chleachdadh

primer air thuaiream

 

6 gu 9 bunaitean de dh'fhaid, a dh'fhaodas a dhol gu iomadh làrach rè tar-sgrìobhadh RNA Anneal gu gach RNA (tRNA, rRNA, agus mRNA)

 

Freagarrach airson tar-sgrìobhaidhean le structar àrd-sgoile cudromach, no nuair a bhios nas lugha de stuth tòiseachaidh ri fhaighinn

 

Toradh cDNA àrd

Tha cDNA air ath-sgrìobhadh air ais bhon RNA gu lèir, nach eilear ag iarraidh mar as trice agus a dh’ fhaodadh comharra an targaid mRNA a lagachadh

 

faigh cDNA air a ghearradh sìos

primers sreath-sònraichte Prìomhairean gnàthaichte ag amas air sreathan mRNA sònraichte leabharlann cDNA sònraichte

 

Leasaich cugallachd

 

A’ cleachdadh primers qPCR reverse

Dìreach cuingealaichte ri synthesis aon ghine targaid

Tar-sgrìobhadh air ais

Tha Reverse transcriptase na enzyme a bhios a’ cleachdadh RNA gus DNA a cho-chur.Tha gnìomhachd RNase aig cuid de na tar-sgrìobhaidhean cùil agus faodaidh iad sreathan RNA a lughdachadh ann an iallan tar-chinealach RNA-DNA às deidh an tar-sgrìobhadh.Mura h-eil gnìomhachd enzymatic RNase aige, faodar RNaseH a chuir ris airson èifeachdas qPCR nas àirde.Tha enzyman a chleachdar gu cumanta a’ toirt a-steach Moloney murine leucemia bhìoras reverse transcriptase agus eun myeloblastoma bhìoras reverse transcriptase.Airson RT-qPCR, tha e air leth freagarrach transcriptase cùil a thaghadh le teirm-sheasmhachd nas àirde, gus an tèid cDNA synthesis a dhèanamh aig teòthachd nas àirde, a’ dèanamh cinnteach gu bheil tar-sgrìobhadh soirbheachail de RNAn le structar àrd-sgoile nas àirde, fhad ‘s a chumas iad an làn ghnìomhachd tron ​​​​ath-bhualadh, a’ leantainn gu ìre nas àirde. Tha cDNA a’ toirt a-mach.

Bathar co-cheangailte:

Ath-sgrìobhadh cùl M-MLV Foreasy

Gnìomhachd RNase H de transcriptase cùil

Tha RNaseH comasach air iallan RNA a lughdachadh bho duplexes RNA-DNA, a’ ceadachadh synthesis èifeachdach de DNA dà-shreath.Ach, nuair a bhios tu a’ cleachdadh mRNA fada mar theamplaid, dh’ fhaodadh an RNA a bhith air a lughdachadh ro-ùine, a’ leantainn gu cDNA truncated.Mar sin, tha e gu tric buannachdail gnìomhachd RNaseH a lughdachadh aig àm clonadh cDNA ma thathar ag iarraidh tar-sgrìobhaidhean fada.An coimeas ri sin, tha tar-sgrìobhaidhean cùil le gnìomhachd RNase H gu tric buannachdail airson tagraidhean qPCR oir bidh iad a ’neartachadh leaghadh duplexes RNA-DNA anns a’ chiad chearcall de PCR.

Dealbhadh primer

Bu chòir primers PCR a thathas a’ cleachdadh airson a’ cheum qPCR ann an RT-qPCR a bhith air an dealbhadh gus a bhith a’ dol thairis air snaim exon-exon, far am faodadh primer leudachaidh a dhol thairis air fìor chrìoch exon-intron.Leis nach eil sreathan DNA genomic anns a bheil intron air an leudachadh, tha an dealbhadh seo a’ lughdachadh a’ chunnart gum bi nithean meallta air an leudachadh bho bhith a’ truailleadh DNA genomic.

Mura h-urrainnear primers a dhealbhadh gus crìochan exons no exon-exon a sgaradh, is dòcha gum feumar sampallan RNA a làimhseachadh le DNase I gun RNase no dsDNase gus truailleadh DNA genomic a thoirt air falbh.

Smachd RT-qPCR

Bu chòir smachd àicheil tar-sgrìobhaidh cùil (-RT smachd) a bhith air a ghabhail a-steach anns a h-uile deuchainn RT-qPCR gus truailleadh DNA a lorg (leithid toraidhean genomic DNA no PCR bho ath-bheachdan roimhe).Anns an smachd seo tha a h-uile pàirt freagairt ach a-mhàin transcriptase cùil.Leis nach eil tar-sgrìobhadh air ais a’ tachairt leis an smachd seo, ma choimheadas tu air leudachadh PCR, tha e nas coltaiche gun tèid truailleadh bho DNA a dhèanamh.


Ùine puist: Lùnastal-02-2022