• facebook
  • ceangailte
  • youtube

Chan urrainn dha tar-sgrìobhaidhean cùil traidiseanta cumail ri teòthachd àrd (is e an teòthachd as fheàrr airson gnìomhachd MMLV 37-50 ° C, agus AMV 42-60 ° C).Chan urrainnear an RNA viral nas iom-fhillte ath-sgrìobhadh gu h-èifeachdach gu cDNA aig teòthachd ìosal, a’ leantainn gu èifeachdas lorg An lughdachadh.Traidiseanta RT-qPCR mar as trice a 'cur feum air com-pàirt dà phrìomh enzymes (reverse transcriptase agus DNA polymerase), a tha ga dhèanamh do-dhèanta a dhèanamh nas sìmplidhe obrachadh an t-siostam ath-bhualadh agus a' lùghdachadh cosgais.An seo bheir sinn a-steach dà ath-sgrìobhadh cùil àrd-teodhachd, TtH agus RevTaq.Tha gnìomh DNA polymerase aig an dà enzyme seo cuideachd, agus mar sin canar enzymes dà-ghnìomhach riutha.

TtH DNA polymerase

Feumaidh gun cuala tu mu dheidhinn TtH, a tha a’ tighinn bhon bacterium thermophilic Thermus thermophilus HB8.Ann an làthaireachd cations divalent leithid Mg2+, tha gnìomhachd DNA polymerase aige.Tha e air a chleachdadh gu farsaing ann an ath-bheachdan PCR mar Taq enzyme, ach tha neart teas nas àirde aige na Taq enzyme, agus mar sin tha buaidh nas fheàrr aige cuideachd air PCR le teamplaidean susbaint àrd GC.

· Gu bunaiteach chan eil gnìomhachd exonuclease 3 ′ → 5 ′ aig an enzyme seo agus gnìomhachd exonuclease 5 ′ → 3 ′, agus mar sin faodar a chleachdadh cuideachd airson sreath dideoxy.

· Tha gnìomhachd RTase aig an enzyme seo.Ann an làthaireachd Mn2+, thèid gnìomhachd RTase àrdachadh.Le bhith a’ cleachdadh na feart seo, faodar a chleachdadh gus ath-sgrìobhadh air ais agus freagairt PCR a dhèanamh anns an aon phìob, is e sin, aon-cheum RT-PCR.Ach, an làthair Mn2+, chan eil cruinneas RT-PCR àrd.Chan eil gnothach aig gnìomhachd RT ri gnìomhachd rnaase H.

· Tha barrachd gnìomhachd Tth-DNA polymerase (pH9, as fheàrr + 55 ℃ ~ + 70 ℃, as àirde +95 ℃) a ’faighinn thairis air na duilgheadasan a tha air adhbhrachadh le structar àrd-sgoile RNA.Faodar an cDNA a thig às a mheudachadh le PCR leis an aon enzyme an làthair ions Mg2+.

· Tha comas Tth-DNA polymerase gus tar-sgrìobhadh cùil agus leudachadh DNA a dhèanamh aig teòthachd àrd a’ fàgail an enzyme seo feumail airson RT-PCR cainneachdail, clonadh, agus mion-sgrùdadh abairt gine de RNA ceallach is bhìorasach.
· Thathas a’ cleachdadh Tth-DNA polymerase airson RT-PCR gus RNA àrdachadh suas gu 1kb.

null
 

Feartan agus buannachdan

Tth DNA polymerase:

• Dèan cinnteach gu bheil meud toraidh ath-bhualadh slabhraidh polymerase (PCR) as fheàrr, co-dhiù 1000 bp ann am freagairt RT-PCR

• Gabh ri deoxyribonucleoside triphosphate atharraichte mar fho-strat

• Gun a bhith co-cheangailte ri gnìomhachd RNase H

• Tha seasmhachd teirmeach àrd aige gus faighinn thairis air duilgheadasan, mar as trice co-cheangailte ris an structar àrd-sgoile àrd a tha an làthair ann an RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

DNA polymerase teas-dhìonach le gnìomhachd transcriptase cùil

Tha RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase na einnsein dà-ghnìomhach, làn teas-dhìonach, le gnìomhan transcriptase cùil agus DNA polymerase a gheibhear tro mean-fhàs stiùirichte agus fuadain.

· Tha leth-beatha RevTaq RT-PCR DNA polymerase aig 95 ° C nas motha na 40 mionaid.

· Tha RevTaq RT-PCR DNA polymerase a’ ceadachadh tar-sgrìobhadh cùil àrd-teòthachd gu dìreach bhon teamplaid RNA, agus faodar an ceum tar-sgrìobhaidh cùil ath-aithris grunn thursan gus barrachd theamplaidean cDNA a ghineadh.

· Tha DNA polymerase RevTaq RT-PCR a’ ceadachadh RT-PCR “ceum neoni” (chan eil ceum tar-sgrìobhaidh cùil isothermal), oir anns a’ cheum leudachaidh cearcallach PCR, bidh tar-sgrìobhadh air ais agus leudachadh DNA a’ tachairt aig an aon àm.Bidh seo cuideachd ag adhartachadh ath-bhualadh ath-sgrìobhaidh cùil aig teòthachd àrd, agus mar sin a’ lughdachadh na duilgheadasan a thig an cois a bhith a’ leaghadh structar làidir àrd-sgoile RNA aig teòthachd àrd.

· Mar thoradh air an fhoirmle tòiseachaidh teth stèidhichte air aptamer, bheir RevTaq RT-PCR DNA polymerase toraidhean nas fheàrr nuair a tha an teòthachd annealing agus leudachaidh nas àirde na 57 ° C.

· Leis gu bheil an enzyme teas-dhìonach, thathas a’ moladh primers agus probes a dhealbhadh le puingean leaghaidh fìor àrd (> 60 ° C).

· Thathas a’ moladh teòthachd a’ cheum annealing/leudachaidh a bharrachadh tro chaisead teodhachd rè a’ phròiseas rèiteachaidh freagairt.

· Mar as àirde an teòthachd, is ann as àirde a bhios sònraichted PCR.Mar as trice bidh an cearcall tar-sgrìobhaidh cùil air a dhèanamh aig teòthachd nas àirde na an cearcall PCR, oir mar as trice tha puing leaghaidh nas àirde aig DNA Primer:Template hybridization na DNA Primer:cDNA Template duplex.

· Tha RevTaq RT-PCR DNA polymerase air a innleachadh gu ginteil agus air a bharrrachadh, agus tha meud amplicon eadar 60-300 bp.

Bidh crìoch lorgaidh DNA polymerase RevTaq RT-PCR a’ ruighinn 4 leth-bhreac /A dhà (2)

Tha an siostam ath-bhualadh as fheàrr (stèidheachadh primers puing leaghaidh àrd) air a shealltainn san fhigear.Tha RevTaq RT-PCR DNA air a stiùireadh le polymerase RT-PCR a’ nochdadh cugallachd nas fheàrr na prìomh mheasgachadh TaqPath 1-step RT-qPCR, agus lorg nas ìsle Sampall caisead caolachaidh.

Barrachd bhuannachdan:

Gnìomh tòiseachaidh luath → Faodar a’ chiad cheum denaturation teirmeach a sheachnadh.

Foirmle aptamer tòiseachaidh teth → Thoir seachad gnìomhachd enzyme 100% sa bhad agus cuir casg air leudachadh neo-shònraichte aig teòthachd ìosal (<57 ° C).

Gnìomh cleavage → Tha an ceum às-tharraing RNA air fhàgail a-mach, oir faodaidh RevTaq RT-PCR DNA polymerase cuideachd sampallan ath-bhualadh amh a phròiseasadh.Faodaidh e sgrios a dhèanamh sa bhad air memblan cealla eukaryotes, bacteria agus bhìorasan ann an cearcall teth RT-PCR.

Ìre stuth amh IVD → inbhean càileachd àrd agus prìsean air leth farpaiseach


Ùine puist: Lùnastal-12-2021