• facebook
  • ceangailte
  • youtube

Sterilization de mholaidhean pìobaireachd agus tiùban EP, msaa.

1. Ullaich 0.1% (mìleamh) DEPC (stuth fìor phuinnseanta) le uisge deionized, cleachd e gu faiceallach ann an cochall ceò, agus stòraich e aig 4 ° C air falbh bhon t-solas;

Tha uisge DEPC na uisge fìor-ghlan air a làimhseachadh le DEPC agus air a sterilachadh le teòthachd àrd agus cuideam àrd.Deuchainn a bhith saor bho RNase, DNase agus proteinase.

2. Cuir an tip pìobaireachd agus an tiùb EP a-steach gu 0.1% DEPC, agus dèan cinnteach gu bheil an tip pìoba agus an tiùb EP air a lìonadh le 0.1% DEP.

3. Dìon bho sholas, leig seasamh, thar oidhche (12-24h)

4. Chan fheum am bogsa anns a bheil an tip agus an tiùb EP a bhith bog ann an DEPC.An dèidh timcheall air an uisge DEPC a thoirt air falbh anns an tip no tiùb EP, pacaich e agus paisg e suas e.

5. 121 ceum Celsius, 30min

6. 180 ceum Celsius, tioram airson grunn uairean a thìde (co-dhiù 3 uairean)

Nota: a.Cleachd miotagan latex agus aghaidhean choimheach nuair a bhios tu a’ làimhseachadh DEPC!b, no às aonais sterilization DEPC, 130 ℃, autoclave 90min (mòran deuchainn-lannan sterilization teòthachd àrd dà uair)

Beachdachaidhean às-tharraing RNA

Dà phrìomh iongantas de fhàilligeadh aonaranachd RNA clò

Lùghdachadh RNA agus fuigheall neo-chunbhalachd ann am figheagan,a thaobh truailleadh, leig dhuinn sùil a thoirt an-toiseach air carson nach eil RNA a chaidh a thoirt a-mach à ceallan cultarach air a lughdachadh gu furasta.Tha co-phàirtean ann an ath-bheachdan às-tharraing RNA a tha ann mar-thà a chuireas bacadh air RNase gu luath.Cuir an lysate ris na ceallan cultarach, agus dìreach ga mheasgachadh, faodar na ceallan gu lèir a mheasgachadh gu mionaideach leis an lysate, agus tha na ceallan air an lusachadh gu tur.Às deidh na ceallan a bhith air an lìomhadh, bidh na grìtheidean gnìomhach anns an lysate a ’cur bacadh sa bhad air an RNase intracellular, agus mar sin tha an RNA fhathast slàn.Is e sin ri ràdh, leis gu bheil na ceallan cultarach air an conaltradh gu furasta agus gu h-iomlan leis an lysate, chan eil an RNA aca air a thruailleadh gu furasta;air an làimh eile, tha an RNA anns an stuth air a lughdachadh gu furasta leis nach eil e furasta do na ceallan anns an stuth fios a chuir gu sgiobalta ris an lysate.air sgàth conaltradh gu leòr.Mar sin,a’ gabhail ris gu bheil dòigh ann air an stuth a thionndadh gu aon chill fhad ‘s a tha e a’ cur bacadh air gnìomhachd RNA, dh’ fhaodadh an duilgheadas truaillidh a bhith air fhuasgladh gu tur.

Is e bleith naitrigean leaghan an dòigh as èifeachdaiche den leithid.Ach, tha an dòigh bleith nitrogen leaghan gu math trioblaideach, gu sònraichte nuair a tha an àireamh de shamhlaichean mòr.Dh'adhbhraich seo an ath rud as fheàrr: an homogenizer.Tha anhomogenizerchan eil an dòigh-obrach a’ beachdachadh air a’ cheist mu mar a tha gnìomhachd RNase air a bhacadh mus tèid fios a chuir gu ceallan leis an lysate, ach an àite sin tha e ag ùrnaigh gu bheil ìre aimhreit clò nas luaithe na an ìre aig a bheil RNase intracellular a’ lughdachadh RN.

Tha buaidh homogenizer dealain nas fheàrr,agus tha buaidh homogenizer glainne truagh, ach san fharsaingeachd, chan urrainn don dòigh homogenizer casg a chuir air truailleadh.Mar sin, ma tha an às-tharraing air a dhol sìos, bu chòir an homogenizer dealain tùsail a chleachdadh airson a bhith a’ bleith le nitrigin leaghaidh;bu chòir an homogenizer glainne tùsail atharrachadh gu homogenizer dealain no air a bhleith gu dìreach le nitrigin leaghaidh.Tha an duilgheadas faisg air 100% comasach.faigh fuasgladh.

Tha adhbharan nas eadar-mheasgte aig an duilgheadas fuigheall neo-chunbhalachd a bheir buaidh air deuchainnean às deidh sin na truailleadh, agus tha na fuasglaidhean eadar-dhealaichte a rèir sin.Ann an co-dhùnadh,ma tha truailleadh no neo-chunbhalachd anns an stuth, feumar an dòigh às-tharraing / imreag airson an stuth deuchainneach sònraichte a mheudachadh.Chan fheum thu na sampallan prìseil agad a chleachdadh airson optimization: faodaidh tu cuid de bheathaichean beaga leithid iasg / cearc a cheannach bhon mhargaidh, thoir am pàirt co-fhreagarrach den stuth airson às-tharraing RNA, agus am pàirt eile airson às-tharraing pròtain - bleith le beul, stamag agus caolan Earrann.

Tha an targaid RNA den RNA a chaidh a thoirt a-mach air a chleachdadh airson diofar dheuchainnean leanmhainn, agus tha na riatanasan càileachd eadar-dhealaichte

Feumaidh togail leabharlainn cDNA ionracas RNA às aonais fuigheall luchd-dìon ath-bhualadh enzyme;Feumaidh ceann a tuath ionracas RNA nas àirde agus riatanasan nas ìsle airson fuigheall bacadh ath-bhualadh enzyme;Chan fheum RT-PCR ionracas RNA ro àrd,ach a 'cur bacadh air ath-bheachdan enzyme.Tha riatanasan fuigheall teann.Bidh an cuir a-steach a’ dearbhadh an toraidh;a h-uile uair is e an amas an RNA fìor-ghlan as àirde fhaighinn, cosgaidh e airgead dha na daoine.

Cruinneachadh/stòradh shampaill

Factaran a tha a’ toirt buaidh air crìonadh Às deidh don sampall am bodhaig beò fhàgail / no an àrainneachd fàis thùsail, tòisichidh na h-enzyman endogenous san sampall a’ lughdachadh RNA,agus tha an ìre truaillidh co-cheangailte ri susbaint enzymes endogenous agus teòthachd.Gu traidiseanta, chan eil ann ach dà dhòigh air casg a chuir air gnìomhachd enzyme endogenous: cuir lysate sa bhad agus homogenize gu mionaideach agus gu sgiobalta;gearradh ann am pìosan beaga agus reothadh sa bhad ann an nitrigin leaghaidh.Feumaidh an dà dhòigh-obrach obrachadh luath.Tha an tè mu dheireadh freagarrach airson a h-uile sampall, agus chan eil am fear mu dheireadh freagarrach ach airson stuthan le susbaint ìosal de cheallan agus enzyman endogenous agus nas fhasa a bhith homogenize.Gu sònraichte, tha e nas fheàrr maothran planntrais, grùthan, thymus, pancreas, spleen, eanchainn, geir, teannachadh fèithe, msaa a reothadh le naitridean lionn mus tèid iad air adhart.

Fragmentation agus homogenization de shamhlaichean

Factaran a tha a 'toirt buaidh air crìonadh agus toradh Is e sgaradh sampallairson homogenization mionaideach, a tha airson sgaoileadh iomlan agus iomlan de RNA.Faodar ceallan a cho-aonachadh gu dìreach gun a bhith briste.Chan urrainnear figheagan a bhith homogenized a-mhàin às deidh a bhith briste.Feumar beirm agus bacteria a bhriseadh le enzyman co-fhreagarrach mus urrainn dhaibh a bhith air an aonachadh.Faodar stuthan le susbaint enzyme nas ìsle agus homogenization nas fhasa a phronnadh agus a homogenized aig aon àm anns an lysate le homogenizer;clò planntrais, grùthan, thymus, pancreas, dinneag, eanchainn, geir, teannachadh fèithe agus sampallan eile, Tha iad an dàrna cuid àrd ann an enzyman endogenous no chan eil iad furasta an aonachadh,mar sin feumar aimhreit clò agus homogenization a dhèanamh air leth.Is e an dòigh brisidh as earbsaiche agus as cinneasaiche a bhith a’ bleith le nitrigin leaghaidh, agus is e an dòigh homogenization as earbsaiche a bhith a ’cleachdadh homogenizer dealain.Nòta sònraichte mu bhith a’ bleith le naitridean lionntach: cha bu chòir an sampall a bhith air a leaghadh tron ​​phròiseas bleith gu lèir, leis gu bheil enzyman endogenous nas dualtaiche obrachadh nuair a bhios iad reòta.

Roghainn de lysate

A’ toirt buaidh air goireasachd obrachaidh agus factaran neo-chunbhalachd endogenous iarmharach Faodaidh na fuasglaidhean lysis a thathas a’ cleachdadh gu cumanta cha mhòr bacadh a chuir air gnìomhachd RNase.Mar sin, is e am prìomh phuing ann a bhith a’ taghadh fuasgladh lysis beachdachadh còmhla ris an dòigh glanaidh.Tha aon eisgeachd ann:Thathas a’ moladh sampallan le susbaint àrd enzymanach a bhith a’ cleachdadh lysate anns a bheil phenol gus an comas àrdachadh air enzyman endogenous a chuir an gnìomh.

Roghainn dòigh glanaidh

Factaran a bheir buaidh air neo-chunbhalachd endogenous fuigheall, astar às-tharraing Airson sampallan glan leithid ceallan, gheibhear toraidhean riarachail le cha mhòr dòigh glanaidh sam bith ri làimh.Ach airson mòran de shamhlaichean eile, gu sònraichte an fheadhainn le ìrean àrda de neo-chunbhalachd leithid planntrais, grùthan, bacteria, msaa, tha e deatamach dòigh glanaidh iomchaidh a thaghadh.Tha astar luath às-tharraing aig an dòigh glanaidh ceud-ghluasadach colbh agus faodaidh e neo-chunbhalachd a thoirt air falbh gu h-èifeachdach a bheir buaidh air an ath-bhualadh enzymatic de RNA, ach tha e daor (faodaidh Foregene innealan cosg-èifeachdach a thabhann, tuilleadh fiosrachaidh cliogan seo);faodaidh cleachdadh dòighean glanaidh eaconamach agus clasaigeach, leithid sileadh LiCl, toraidhean riarachail fhaighinn, ach tha an ùine obrachaidh fada..

“Trì smachdan agus ochd aire” airson tarraing RNA

Smachd 1:Cuir stad air truailleadh enzymes exogenous.

Nota 1:Cleachd gu teann masgaichean agus miotagan.

Nota 2:Bu chòir faighinn cuidhteas gu mionaideach na tiùban centrifuge, cinn Tip, slatan pìoba, tancaichean electrophoresis, agus beingean deuchainneach a tha an sàs san deuchainn.

Nota 3:Feumaidh na h-ath-bheachdan / fuasglaidhean a tha an sàs san deuchainn, gu sònraichte uisge, a bhith saor bho RNase.

Smachd 2:Cuir casg air gnìomhachd enzyman endogenous

Nota 4:Tagh dòigh homogenization iomchaidh.

Nota 5:Tagh lysate iomchaidh.

Nota 6:Smachd air meud tòiseachaidh an t-sampall.

Smachd 3:Dèan soilleireachadh air an adhbhar às-tharraing agad

Nota 7:Le siostam lysate sam bith a’ tighinn faisg air an ìre tòiseachaidh as àirde de shampall, bidh an ìre soirbheachaidh às-tharraing a’ tuiteam gu mòr.

Nota 8:Is e an aon shlat-tomhais eaconamach airson às-tharraing RNA soirbheachail soirbheachadh ann an deuchainnean às deidh sin, chan e toradh.

Na 10 stòran as fheàrr de thruailleadh RNase

1. Is e corragan a 'chiad thùs de enzymes exogenous, agus mar sin feumaidh miotagan a bhith air an caitheamh agus air an cur nan àite gu tric.A bharrachd air an sin, feumar masgaichean a chaitheamh cuideachd, oir tha anail cuideachd na stòr cudromach de enzyman.Is e buannachd a bharrachd a bhith a’ caitheamh masg miotag an neach-deuchainn a dhìon.

2. Molaidhean pìoba, pìoban centrifuge, pìobairean - chan urrainn dha RNase a bhith air a chur an gnìomh le sterilization a-mhàin, agus mar sin bu chòir molaidhean pìobaireachd agus pìoban centrifuge a bhith air an làimhseachadh le DEPC, eadhon ged a tha iad air an comharrachadh mar DEPC air an làimhseachadh.Tha e nas fheàrr pìobaire adhbhar sònraichte a chleachdadh, a sguabadh le ball cotan 75% alcol mus tèid a chleachdadh, gu sònraichte an t-slat;A bharrachd air an sin, dèan cinnteach nach cleachd thu inneal toirt air falbh.

3. Feumaidh an t-uisge/bufair a bhith saor bho thruailleadh RNase.

4. Co-dhiù bu chòir an clàr deuchainn a bhith air a ghlanadh le bàlaichean cotan 75% alcol.

5. Endogenous RNase Tha enzyman endogenous anns a h-uile inneal, agus mar sin is e reothadh luath de fhigheagan le nitrigin leaghaidh an dòigh as fheàrr air truailleadh a lughdachadh.Tha an dòigh stòraidh / bleith naitrigean leaghan gu dearbh mì-ghoireasach, ach is e seo an aon dòigh air stuthan le ìrean àrda de enzyman endogenous.

6. Sampaill RNA Faodaidh comharran de thruailleadh RNase a bhith ann am bathar às-tharraing RNA.

7. Às-tharraing plasmid Bidh às-tharraing plasma gu tric a’ cleachdadh Rnase gus RNA a dhì-mhilleadh, agus bu chòir an Rnase a tha air fhàgail a bhith air a chnàmh le Proteinase K agus air a thoirt a-mach le PCI.

8. Stòradh RNA Fiù ma tha e air a stòradh aig teòthachd ìosal, bidh meudan lorg de RNase ag adhbhrachadh truailleadh RNA.Is e am fuasgladh as fheàrr airson RNA a ghleidheadh ​​​​fad-ùine casg salainn / deoch làidir, leis gu bheil alcol a’ cur bacadh air gnìomhachd enzymatic aig teòthachd ìosal.

9. Nuair a bhios na h-ianan sin ann an cations (Ca, Mg), bidh teasachadh aig 80C airson 5 mionaidean ag adhbhrachadh gum bi RNA air a ghlanadh, agus mar sin ma dh'fheumas RNA a theasachadh, feumaidh inneal chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4) a bhith anns an fhuasgladh gleidhidh.

10. Faodaidh einnseanan a chleachdar ann an deuchainnean às dèidh làimh a bhith air an truailleadh le RNase.

10 molaidhean airson tarraing RNA

1: Cuir casg air gnìomhachd RNase gu sgiobalta.Bidh sampaill air an reothadh gu sgiobalta às deidh an cruinneachadh, agus tha RNase air a chuir an gnìomh le gnìomhachd luath rè lysis.

2: Tagh dòigh às-tharraing iomchaidh airson clò le susbaint àrd ribozyme, agus tha e nas fheàrr maothran adipose an dòigh anns a bheil phenol a chleachdadh.

3: Feumaidh càileachd ro-innse a Tuath, feumaidh togail leabharlainn cDNA ionracas àrd, agus chan fheum RT-PCR agus RPA (measadh dìon Ribonuclease) ionracas àrd.Feumaidh RT-PCR fìor-ghlan (fuigheall bacadh enzyme).

4: Is e homogenization mionaideach an dòigh as fheàrr air toradh a leasachadh agus lughdachadh truailleadh.

5: Thoir sùil air ionracas lorg electrophoresis RNA, tha 28S: 18S = 2: 1 na shoidhne iomlan, tha 1: 1 cuideachd iomchaidh airson a’ mhòr-chuid de dheuchainnean.

6: toirt air falbh DNA airson RT-PCR, mion-sgrùdadh array Tha e nas fheàrr Dnase I a chleachdadh gus DNA a thoirt air falbh.

7: Lùghdaich truailleadh enzymes exogenous - chan urrainnear enzyman a thoirt a-steach bhon taobh a-muigh.

8: Nuair a bhios tu a’ cuimseachadh searbhag niuclasach le dùmhlachd ìosal, bu chòir imoibrí co-sileadh a chur ris.Ach gus casg a chur air an co-precipitant anns a bheil enzymes agus truailleadh DNA.

9: Sgaoil an RNA gu mionaideach, ma tha sin riatanach, teas aig 65C airson 5 mionaidean.

dòigh stòraidh iomchaidh

Faodar a stòradh aig -20C airson ùine ghoirid, agus aig -80C airson ùine mhòr.Is e a’ chiad cheum ann a bhith a’ leasachadh toradh RNA a bhith mothachail gu bheil susbaint RNA diofar shamhlaichean ag atharrachadh gu mòr.Pailteas àrd (2-4ug / mg) leithid grùthan, pancreas, cridhe, pailteas meadhanach (0.05-2ug / mg) leithid eanchainn, embryo, dubhaig, sgamhan, thymus, ovary, pailteas ìosal (<0.05ug / mg) mg) leithid bladder, cnàimh, geir.

1: Cealla Lyse gus RN a leigeil ma sgaoil - mura tèid RNA a leigeil ma sgaoil, thèid an toradh a lughdachadh.Bidh homogenization dealain ag obair nas fheàrr na dòighean homogenization eile, ach is dòcha gum feumar a chur còmhla ri dòighean eile, leithid mashing nitrogen leaghaidh, cnàmhadh enzymatic (Lysozyme / Lyticase)

2: Optimization den dòigh às-tharraing.Is e na duilgheadasan as motha le dòighean stèidhichte air phenol srathachadh neo-choileanta agus call pàirt RNA (chan urrainnear an supernatant a thoirt air falbh gu tur).Tha sreathadh neo-choileanta mar thoradh air searbhag niuclasach àrd agus susbaint pròtain, a dh’ fhaodar fhuasgladh le bhith a’ meudachadh na tha de lysate air a chleachdadh no a’ lughdachadh na tha de shampall.Chaidh ceum de tharraing cloroform a chur ris an stuth adipose.Faodar call RNA a lughdachadh le bhith a’ pumpadh cùil no le bhith a’ toirt air falbh an còmhdach organach agus an uairsin centrifugation.Is e an duilgheadas as motha le dòighean stèidhichte air centrifugation colbh cus sampall.

Molaidhean tarraing clasaigeach

1. Glanadh phenol: Cuir ris an aon tomhas-lìonaidh de 1:1 phenol/Chloroform agus measgachadh gu làidir airson 1-2 mhionaid.Centrifuge aig astar àrd airson 2 mhionaid.Thoir air falbh gu faiceallach an supernatant (80-90%).Na bi a-riamh a 'faighinn chun an t-sreath mheadhanach.Faodar tomhas co-ionann den fhuasgladh ath-bhualadh a chur ri phenol / cloroform agus an supernatant a thoirt air falbh.Faodar an dà supernatants a mheasgachadh còmhla airson sileadh searbhag niuclasach gus an toradh a leasachadh.Na bi ro shnog nuair a bhios tu a’ measgachadh, agus na feuch ris a h-uile supernatant a thoirt air falbh.

2. Nigheadaireachd le 70-80% ethanol: Rè a bhith a 'nighe, feumar an t-searbhag nucleic a chuir dheth gus dèanamh cinnteach gu bheil an salann a tha air fhàgail air a nighe air falbh.Aig an aon àm, dìreach an dèidh a 'dòrtadh dheth an ethanol, centrifuge aig àrd-astar airson beagan dhiog, agus an uair sin a thoirt air falbh an còrr ethanol le pipette.Fuasgladh às deidh seasamh aig teòthachd an t-seòmair airson 5-10 mionaidean.

11. Extraction de bhuidhnean sònraichte

1. Maothran snàithleach: 'S e an rud as cudromaiche airson tarraing RNA à clò snàithleach leithid fèithean cridhe/cnàimheach a bhith a' cur dragh air an stuth.Tha dùmhlachd cealla ìosal aig na nèapraigean sin, agus mar sin tha an ìre de RNA gach aonad cuideam clò ìosal, agus tha e nas fheàrr a bhith a’ cleachdadh nas urrainn dhut den t-suim tòiseachaidh.Dèan cinnteach gu bheil thu a 'bleith an stuth gu math fo chumhachan reòta.

2. Stuthan le tòrr pròtain/geir: tha tòrr geir san eanchainn/glasraich.Às deidh toirt a-mach PCI, tha floccules geal anns an supernatant.Feumaidh an supernatant a bhith air a tharraing a-rithist le cloroform.

3. Fìnean le susbaint àrd searbhag niuclasach/ribozyme: tha susbaint àrd searbhag niuclasach agus ribozyme anns an dinneag/thymus.Faodaidh a bhith a’ bleith maothran fo chumhachan reòta agus an uairsin homogenization luath ribozymes a chuir an gnìomh gu h-èifeachdach.Ach, ma tha an lysate ro slaodach (mar thoradh air susbaint àrd searbhag niuclasach), cha bhith e comasach don às-tharraing PCI sreathadh gu h-èifeachdach;Le bhith a’ cur barrachd lysate ri fuasgladh fhaighinn air a’ chùis seo.Faodaidh ioma-tharraing PCI barrachd DNA a tha air fhàgail a thoirt air falbh.Ma thèid sileadh geal a chruthachadh sa bhad às deidh alcol a chuir ris, tha e a’ nochdadh truailleadh DNA.Faodaidh ath-tharraing le PCI searbhagach às deidh sgaoileadh truailleadh DNA a thoirt air falbh.

4. Stuth planntrais: Tha clò planntrais nas iom-fhillte na clò bheathaichean.San fharsaingeachd, bidh planntrais air an talamh fo chumhachan nitrigin leaghaidh, agus mar sin tha truailleadh RNA le enzyman endogenous neo-chumanta.Mura tèid an duilgheadas truaillidh a rèiteachadh, cha mhòr gu cinnteach tha e air adhbhrachadh le neo-chunbhalachd anns an sampall.Bidh na neo-chunbhalachd a tha ann am mòran de phlanntaichean a’ leantainn gu fuigheall, agus is e an adhbhar airson fuigheall gu tric air sgàth gu bheil cuid de rudan coltach ri RNA aig na neo-chunbhalachd sin: bidh thu a’ frasadh agus bidh mi a’ frasadh, agus bidh thu a’ gabhail a-steach agus mise a’ gabhail ris.Tha na feartan sin a’ dearbhadh gu bheil iad nan luchd-dìon enzyme glè làidir.

Aig an àm seo, faodar ath-bheachdan às-tharraing RNA malairteach atharrachadh gu cha mhòr a h-uile stuth beathach le atharrachaidhean beaga, ach chan eil mòran ath-bheachdan às-tharraing RNA malairteach a dh’ fhaodadh a bhith freagarrach airson a ’mhòr-chuid de fhigheagan planntrais.Gu fortanach, faodaidh Foregene sònraichte a thoirt seachadinnealan às-tharraing RNA planntrais, Tha againnLusan pasgan Iomlan RNA Iomallach, Cuir pasgan Iomallach Iomlan RNA Plus.Tha an tè mu dheireadh air a dhealbhadh gu sònraichte airson lusan le susbaint àrd polysaccharide agus polyphenol.Airson às-tharraing RNA, tha fios air ais bho luchd-cleachdaidh obair-lann gu sònraichte math.

12. A 'bhuaidh a th' aig reothadh sampall agus a 'leaghadh Faodaidh an sampall reòta a bhith nas motha, agus feumar a ghearradh mus tèid a chleachdadh airson às-tharraing RNA.Bidh sampaill buailteach a leaghadh (is dòcha gu ìre) rè gearradh.Is dòcha gum feumar sampallan reòta a bhith air an tomhas mus tèid RNA a thoirt a-mach, agus bidh leaghadh gu cinnteach a’ tachairt tron ​​​​phròiseas seo.Aig amannan, bidh leaghadh an t-sampall cuideachd a’ tachairt tron ​​phròiseas bleith nitrogen leaghan;no thèid an sampall reòta a chuir gu dìreach ris an lysate às aonais bleith naitridean leaghaidh, agus bidh leaghadh gu cinnteach a’ tachairt ron homogenization iomlan.Tha deuchainnean air sealltainn gu bheil clò reòta nas buailtiche do mhilleadh RNA aig àm leaghadh na clò ùr.An adhbhar a dh’fhaodadh a bhith ann: Bidh am pròiseas reòdhais a’ cur dragh air structaran taobh a-staigh na cealla, ga dhèanamh nas fhasa dha enzyman endogenous a bhith a’ conaltradh gu dìreach ris an RNA.

13. A' breithneachadh càileachd RNA Mar as trice, bithear a' cleachdadh electrophoresis gus ionracas RNA a bhreithneachadh, agus thathas a' cleachdadh A260/A280 gus purrachd RNA a mheas.Ann an teòiridh, tha co-mheas de 28S:18S = 2.7:1 aig RNA slàn, agus tha a’ mhòr-chuid de dhàta a’ cur cuideam air a’ cho-mheas de 28S:18S = 2:1.Is e an fhìrinn nach eil cha mhòr gin den RNA a chaidh a thoirt a-mach à sampallan a bharrachd air ceallan ann an co-mheas 2: 1 (fhuaireadh seo a’ cleachdadh an Agilent Bioanalyzer).

Tha mòran fhactaran a 'toirt buaidh air toraidhean electrophoresis RNA, a' gabhail a-steach structar àrd-sgoile, suidheachaidhean electrophoresis, luchd sampall, ìre sùghaidh le EB, msaa.Ma tha an 28S aig 2kb agus an 18S aig 0.9kb soilleir, agus 28S: 18S > 1, faodaidh an ionracas coinneachadh ri riatanasan a’ mhòr-chuid de dheuchainnean às deidh sin.

Tha A260 / A280 na chomharradh a tha air tòrr troimh-chèile adhbhrachadh.An toiseach, feumar brìgh tùsail a’ chomharra seo a shoilleireachadh airson searbhagan niuclasach: RNA fìor-ghlan, a A260/280 = timcheall air 2.0.Is e RNA fìor-ghlan an ‘adhbhar’ agus is e A260/A280 = 2 am ‘buaidh’.A-nis tha a h-uile duine a’ cleachdadh A260 / A280 mar ‘adhbhar’, a’ smaoineachadh “ma tha A260 / A280 = 2, an uairsin tha RNA fìor-ghlan”, a tha gu nàdarrach a’ leantainn gu troimh-chèile.

Ma tha ùidh agad, faodaidh tu beagan reagent a chleachdadh gu tric ann an às-tharraing, leithid phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, msaa, ris an sampall RNA agad, agus an uairsin tomhas an co-mheas A260 / A280.Is e an fhìrinn gu bheil mòran de na h-ath-bheachdan a thathas a’ cleachdadh airson às-tharraing RNA, a bharrachd air mòran neo-chunbhalachd san sampall, a’ gabhail a-steach timcheall air A260 agus A280, a’ toirt buaidh air A260 / A280.

Is e an dòigh as adhartaiche an-dràsta a bhith a’ sganadh sampaill RNA anns an raon 200-300 nm.Tha na feartan a leanas aig lùb RNA fìor-ghlan: tha an lùb rèidh, tha A230 agus A260 nan dà phuing tionndaidh, tha A300 faisg air 0, A260/A280 = timcheall air 2.0, agus A260/A230 = timcheall air 2.0.Mura h-eil dàta scan ri fhaighinn, feumar an co-mheas A260 / A230 a dhearbhadh cuideachd, leis gu bheil an co-mheas seo nas mothachail air a h-uile neo-chunbhalachd a bheir buaidh air an ath-bhualadh enzymatic.Thoir aire do raon sreathach an inneil (0.1-0.5 airson A260).

Tha dà iongantas feumail eile ann: bidh an co-mheas timcheall air 0.3 nas ìsle nuair a thèid A260 / A280 a thomhas ann an uisge;fhad ‘s a tha an co-mheas a chaidh a thomhas ann an EDTA 10 mM timcheall air 0.2 nas àirde na an ìre a chaidh a thomhas ann an EDTA 1 mM.

Bathar co-cheangailte:

Dèanadair agus Solaraiche Kit Iomallach Iomlan RNA Sìona Plant |Foregene (foreivd.com)

Sreath iomallachd RNA Solaraichean agus Factaraidh |Luchd-saothrachaidh sreath aonaranachd RNA Sìona (foreivd.com)

Sreath iomallachd RNA - Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)


Ùine puist: Iuchar-15-2022