Mar obair ùr san obair-lann, chan e obair mhath a th’ ann a bhith a’ faighinn a-mach planntaichean adhartach bho ghrunn phlanntaichean le ìre tionndaidh ìosal.An toiseach, feumar DNA a thoirt a-mach à àireamh mhòr de shamhlaichean aon às deidh aon, agus an uairsin lorgar na ginean cèin le PCR.Ach, bidh na toraidhean gu tric falamh agus còmhlain le beagan rudan bho àm gu àm, ach tha e do-dhèanta faighinn a-mach a bheil lorgan air chall no lorgan meallta..A bheil e gu math gun chuideachadh a bhith an aghaidh a leithid de phròiseas deuchainneach agus toraidhean?Na gabh dragh, bidh bràthair a’ teagasg dhut mar a nì thu sgrìonadh air planntaichean adhartach tar-ghnèitheach gu furasta agus gu ceart.

Ceum 1

Dealbhadh primers lorgaidh

Obraich a-mach an gine endogenous agus gine exogenous a thèid a lorg a rèir an sampall a thèid a dhearbhadh, agus tagh sreath riochdachail 100-500bp anns a’ ghine airson dealbhadh primer.Faodaidh deagh primers dèanamh cinnteach gu bheil na toraidhean lorgaidh ceart agus an ùine lorgaidh a ghiorrachadh (faic an eàrr-ràdh airson primers lorgaidh a chleachdar gu cumanta).

Sanas: Feumaidh na primers a chaidh an dealbhadh às ùr na suidheachaidhean freagairt as fheàrr a dhèanamh agus dearbhadh cruinneas, mionaideachd agus crìoch lorgaidh an lorg mus lorgar iad air sgèile mhòr.

Ceum 2

Dealbhadh protocol deuchainneach

Smachd adhartach: Cleachd an DNA fìor-ghlan anns a bheil a’ chriomag targaid mar theamplaid gus faighinn a-mach a bheil an siostam freagairt PCR agus na suidheachaidhean àbhaisteach.

Smachd àicheil / bàn: Cleachd an teamplaid DNA no ddH2O anns nach eil am criomag targaid mar theamplaid gus faighinn a-mach a bheil stòr truailleadh san t-siostam PCR.

Smachd iomraidh taobh a-staigh: cleachd am measgachadh primer / probe de ghine endogenous an t-sampall a thèid a dhearbhadh gus measadh an lorgar an teamplaid le PCR.

Sanas:

Bu chòir smachdan adhartach, àicheil/bàn agus smachdan in-smachd a shuidheachadh airson gach deuchainn gus measadh a dhèanamh air èifeachd nan toraidhean deuchainneach.

Ullachadh deuchainn

Mus tèid a chleachdadh, faic a bheil am fuasgladh air a mheasgachadh gu cothromach.Ma lorgar sileadh, feumar a sgaoileadh agus a mheasgachadh a rèir an stiùiridh mus tèid a chleachdadh.Feumar measgachadh 2 × PCR a phìobadh agus a mheasgachadh a-rithist le micropipette mus tèid a chleachdadh gus cuairteachadh ian neo-chòmhnard a sheachnadh.

Sanas:

Thoir a-mach an leabhar-làimhe agus leugh gu faiceallach e, agus dèan ullachadh ron deuchainn a rèir riatanasan an leabhair-làimhe.

Ceum 4

Ullaich siostam freagairt PCR

A rèir a’ phròtacal deuchainneach, measgachadh na primers, H2O, agus measgachadh 2 × PCR gu cothromach, centrifuge agus sgaoil iad gu gach tiùb freagairt.

Sanas:

Airson deuchainn mòr no fad-ùine, thathas a ’moladh siostam ath-bhualadh PCR a chleachdadh anns a bheil enzyme UNG, a dh’ fhaodas truailleadh aerosol adhbhrachadh le toraidhean PCR a sheachnadh.

Ceum 5

Cuir ris an teamplaid reaction

A ’cleachdadh teicneòlas Direct PCR, chan eil feum air pròiseas glanaidh searbhag niuclasach tedious, faodar an teamplaid sampall ullachadh taobh a-staigh 10 mionaidean, agus faodar an siostam freagairt PCR co-fhreagarrach a chuir ris.

Sanas:

Tha buaidh lorgaidh nas fheàrr aig an dòigh cleavage, agus faodar an toradh a gheibhear a chleachdadh airson ioma ath-bheachdan lorg.

5.1: Leudachadh dìreach de dhuilleagan

A rèir meud an deilbh anns an leabhar-làimhe, gearraich an clò duilleach le trast-thomhas de 2-3mm agus cuir e ann an siostam freagairt PCR.

Nota: Dèan cinnteach gu bheil na pìosan duilleach air am bogadh gu tur ann am fuasgladh ath-bhualadh PCR, agus na cuir cus clò duille ris.

5.2: Modh sgoltadh dhuilleagan

Gearr clò na duilleige le trast-thomhas de 5-7mm agus cuir ann an tiùb centrifuge e.Ma roghnaicheas tu duilleagan aibidh, feuch gun a bhith a’ cleachdadh nèapraigean prìomh veine na duilleige.Bidh Pipette 50ul Buffer P1 a ’sìoladh a-steach do phìob centrifuge gus dèanamh cinnteach gun urrainn don lysate an clò duilleach a bhogadh gu tur, a chuir ann an cearcall teirmeach no amar meatailt, agus lyse aig 95 ° C airson 5-10 mionaidean.

Cuir ris fuasgladh neodachaidh 50ul Buffer P2 agus measgachadh gu math.Faodar an lysate a thig às a chleachdadh mar theamplaid agus a chur ris an t-siostam freagairt PCR.

Nota: Tha an tomhas teamplaid eadar 5-10% den t-siostam PCR, agus cha bu chòir dha a bhith nas àirde na 20% (mar eisimpleir, ann an siostam PCR 20μl, cuir 1-2μl de fhuasgladh lysis, gun a bhith nas fhaide na 4μl).

Ceum 6

Freagairt PCR

Às deidh centrifuging an tiùb freagairt PCR, tha e air a chuir ann an ionnstramaid PCR airson leudachadh.

Sanas:

Bidh an ath-bhualadh a’ cleachdadh teamplaid neo-ghlan airson leudachadh, agus mar sin tha an àireamh de chuairtean leudachaidh 5-10 barrachd chuairtean na nuair a bhios tu a’ cleachdadh teamplaid DNA fìor-ghlan.

Ceum 7

Lorgaidh electrophoresis agus mion-sgrùdadh toraidh

M: 100bp DNA àradh

1 \ 4: Modh DNA air a ghlanadh

2 \ 5: Modh PCR dìreach

3 \ 6: Smachd falamh

QC:

Bu chòir toraidhean deuchainn nan diofar smachdan a chaidh a shuidheachadh san deuchainn coinneachadh ris na cumhaichean a leanas.Rud eile, bu chòir adhbhar na duilgheadas a sgrùdadh, agus bu chòir an deuchainn a dhèanamh a-rithist às deidh an duilgheadas a chuir às.

Clàr 1. Toraidhean deuchainn àbhaisteach de dhiofar bhuidhnean smachd

* Nuair a thèid am plasmid a chleachdadh mar smachd adhartach, faodaidh toradh deuchainn gine endogenous a bhith àicheil

Co-dhùnadh toraidh:

A. Tha toradh deuchainn gine endogenous an t-sampall àicheil, a 'sealltainn nach urrainnear an DNA a tha freagarrach airson lorg PCR àbhaisteach a thoirt a-mach às an sampall no gu bheil bacadh ath-bhualadh PCR anns an DNA a chaidh a thoirt a-mach, agus bu chòir an DNA a thoirt a-mach a-rithist.

B. Tha toradh deuchainn gine endogenous an t-sampall dearbhach, agus tha toradh deuchainn a 'ghine exogenous àicheil, a' sealltainn gu bheil DNA a tha freagarrach airson lorg PCR àbhaisteach air a thoirt a-mach às an sampall, agus faodar a bhreithneachadh nach eil an gine XXX air a lorg san sampall.

C. Tha toradh deuchainn gine endogenous an t-sampall dearbhach, agus tha toradh deuchainn a’ ghine exogenous dearbhach, a’ nochdadh gun deach DNA a tha freagarrach airson lorg PCR àbhaisteach a thoirt a-mach às an sampall, agus tha gine XXX anns an sampall DNA.Faodar tuilleadh deuchainnean dearbhaidh a dhèanamh.

Ceum 8

Dealbhadh primers lorgaidh

Às deidh an deuchainn, cleachd fuasgladh sodium hypochlorite 2% agus fuasgladh ethanol 70% gus an raon deuchainneach a ghlanadh gus casg a chuir air truailleadh na h-àrainneachd.