PCR, iomadaidh PCR, PCR na àite, Cuir air ais PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Rèitichidh sinn bun-bheachdan, ceumannan agus mion-fhiosrachadh mu dhiofar PCR

Ⅰ. PCR

Tha Polymerase Chain Reaction, ris an canar PCR, na theicneòlas bith-eòlasach moileciuil a thathas a’ cleachdadh gus mìrean DNA sònraichte a leudachadh.Faodar a mheas mar mhac-samhail DNA sònraichte in vitro.Chaidh DNA polymerase (DNA Polymerase I) a lorg cho tràth ri 1955, agus chaidh Klenow Fragment of E. Coli, aig a bheil luach deuchainneach agus practaigeach, a lorg leis an Dr H. Klenow tràth anns na 1970n, ach leis nach eil an enzyme seo a ’gabhail ri teòthachd, faodaidh teòthachd àrd a lughdachadh, agus mar sin chan eil e a’ coinneachadh ris an ath-bhualadh slabhraidh polymerase degeneration le teòthachd àrd.Chaidh na h-enzyman a thathas a’ cleachdadh an-diugh (ris an canar Taq polymerase), a sgaradh bho Thermus aquaticus, bacterium teth earraich ann an 1976. Is e an fheart aige gum faod e seasamh an aghaidh teòthachd àrd agus gu bheil e na shàr enzyme, ach tha e air a chleachdadh gu farsaing às deidh na 1980n.Tha bun-bheachd tùsail a 'phròtacal tùsail de PCR coltach ri càradh gine agus copaidh, a chaidh a mholadh leis an Dr KJell Kleppe ann an 1971. Dh'fhoillsich e a 'chiad lethbhreac gine sìmplidh agus geàrr-ùine (coltach ris a' chiad dà ath-bheachdan cearcall de PCR).Chaidh am PCR a chaidh a leasachadh an-diugh a leasachadh leis an Dotair Kary B. Mullis ann an 1983. Bha an Dr. Mullis a’ frithealadh chompanaidhean PE a’ bhliadhna sin, agus mar sin tha inbhe shònraichte aig PE anns a’ ghnìomhachas PCR.Dh'fhoillsich an Dotair Mullis gu h-oifigeil a' chiad phàipear co-cheangailte ri Saiki agus feadhainn eile ann an 1985. Bhon uairsin, tha cleachdadh PCR mìltean de mhìltean san latha, agus faodar a ràdh gu bheil càileachd phàipearan co-cheangailte a 'dèanamh mòran dhòighean rannsachaidh eile mì-fhreagarrach.Às deidh sin, tha teicneòlas PCR air a chleachdadh gu farsaing ann an rannsachadh saidheansail bith-eòlasach agus tagraidhean clionaigeach, a’ tighinn gu bhith mar an teicneòlas as cudromaiche ann an sgrùdadh bith-eòlas moileciuil.Bhuannaich Mullis an Duais Nobel ann an Ceimigeachd ann an 1993.

PCRPrionnsabal

Tha prionnsapal bunaiteach teicneòlas PCR coltach ri pròiseas ath-riochdachadh nàdarra DNA, agus tha a shònrachas an urra ris a’ phrìomhaire oligonucleotide a tha a’ cur ri gach ceann den t-sreath targaid.Tha PCR air a dhèanamh suas de degeneration-annealing-leudachadh trì ceumannan ath-bheachdan bunaiteach: ① crìonadh teamplaid DNA: Às deidh an teamplaid DNA a theasachadh gu timcheall air 93 ° C airson ùine sònraichte, bidh am fuasgladh DNA dùbailte airson an DNA dà-slabhraidh air a chruthachadh le leudachadh PCR air an teamplaid DNA Leaving, ga dhèanamh na shlabhraidh singilte gus an gabh a chur còmhla ris an ath-bhualadh primer gus ullachadh airson an ath ath-bhualadh.②An annealing (cumadh) den teamplaid DNA agus an primer: Às deidh an teamplaid DNA a bhith air a theasachadh agus air a dhol sìos gu aon shlabhraidh, bidh an teòthachd a’ tuiteam gu timcheall air 55 ° C.An t-sreath co-phàirteach den primer agus an teamplaid DNA aon-shlabhraidh.③ Leudachadh an primer: teamplaid DNA - tha an ceangal primer stèidhichte air gnìomh TaqDNA polymerase, le dNTP mar an stuth amh freagairt.Cùm prionnsapal mac-samhail, cuir slabhraidh leth-bhreac leth-ghlèidhte ùr còmhla a chuireas ris an t-sèine DNA teamplaid, agus ath-aithris crìonadh degeneration-annealing-extension faodaidh trì pròiseasan barrachd “slabhraidh leth-ghlèidhte” fhaighinn, agus tha an t-sreath ùr seo ri fhaighinn a-rithist Bi nad theamplaid airson an ath chearcall.Bheir e 2-4min airson an lùb a chrìochnachadh, faodar an gine targaid a mheudachadh grunn mhillean uair ann an 2-3 uairean.

InbhePCRSiostam freagairt

Còig eileamaidean de fhreagairt PCR

Tha sa mhòr-chuid còig seòrsaichean de stuthan an sàs ann an ath-bhualadh PCR, is e sin primer, enzyme, dNTP, teamplaid agus bufair (Mg2+ a dhìth).[Dòigh-obrach PCR]

Tha am pròiseas àbhaisteach PCR air a roinn ann an trì ceumannan

1. Lùghdachadh DNA (90°C-96°C): Teamplaidean DNA dà-slabhraidh fo ghnìomhachd teirmeach, bannan haidridean a' briseadh, a' cruthachadh DNA aon-slabhraidh.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Tha teòthachd an t-siostaim air a lughdachadh, tha am primer air a chur còmhla ris an teamplaid DNA gus slabhraidh dà-chànanach a chruthachadh.

3. Leudachadh (70 ℃ -75 ℃): Fo ghnìomhachd Taq enzyme (timcheall air 72 ° C, an gnìomhachd as fheàrr), tha dNTP air a chleachdadh mar an stuth amh, leudaich bho cheann 5 ′ den primer → 3 ′ deireadh, bidh synthesis agus teamplaid a ’cur ri chèile slabhraidh DNA.

Tha gach cearcall air a dhì-nàdarachadh, air a cheangal agus air a leudachadh, a’ dùblachadh susbaint DNA.Aig an àm seo, mar thoradh air an raon leudachaidh goirid, faodar cuid de PCR ath-aithris ann an ùine gu math goirid eadhon ged nach eil gnìomhachd enzyme Taq as fheàrr, agus mar sin faodar atharrachadh gu dà cheum, is e sin, faodar an annealing agus an leudachadh a dhèanamh aig 60 ° C-65 ° C aig an aon àm.Gus am pròiseas togail is fuarachadh a lughdachadh agus astar freagairt adhartachadh.

Feartan PCR Reaction

● Àrd-Sònrachadh

Is iad na factaran cinnteach sònraichte ann am freagairt PCR: ① Am measgachadh sònraichte den primer agus an teamplaid DNA.② Prionnsabal na bun-càradh.③ Tha dìlseachd freagairt synthesis polymerase TaqDNA.④ Sònraichte agus glèidhteachas a’ ghine targaid.

Is e am measgachadh ceart de primers agus teamplaidean an iuchair.Tha ceangal an primer agus an teamplaid agus leudachadh air an t-sreath primer stèidhichte air prionnsapal maidseadh bunait alcaileach.Faodar dìlseachd ath-bheachdan synthesis polymerase agus an aghaidh teòthachd àrd an Taq DNA polymerase gus ceangal (cumadh) an teamplaid agus an primer san ath-bhualadh a dhèanamh aig teòthachd nas àirde.Tha sònrachas a’ chothlamadh air a mheudachadh gu mòr.Faodaidh an clip ìre àrd de cheartachd a chumail.Le bhith a’ taghadh sgìre ginteil targaid le àrd ghlèidhteachas agus àrd ghlèidhidh, tha a shònrachas nas àirde.

● Àrd Mothachadh

Tha meud cinneasachaidh thoraidhean PCR air a mheudachadh le clàr-amais, a dh’ fhaodas an teamplaid tòiseachaidh de Picker (PG = 10-12) a leudachadh gus ìre microcontroller àrdachadh gu ìre micrograms (μg = -6).Faodar ceallan targaid a lorg bho 1 millean cealla;ann a bhith a’ lorg bhìorasan, faodaidh cugallachd PCR ruighinn 3 RFU (aonadan cruthaichte spotan falamh);Is e an ìre lorgaidh as ìsle ann an saidheans bacteria 3 bacteria.

● Simple agus luath

Bidh am meòrachadh PCR a’ cleachdadh polymerase DNA aig teòthachd àrd Taq, a chuireas am fuasgladh freagairt aig aon àm, is e sin, ath-bhualadh degeneration-anneal-leudachadh air fuasgladh meudachaidh DNA agus poit amar uisge.San fharsaingeachd, thèid am freagairt leudachaidh a chrìochnachadh ann an 2 gu 4 uairean.Mar as trice bidh toraidhean leasaichte air an sgrùdadh le claidheamh dealain, agus chan fheum iad isotopan a chleachdadh, gun truailleadh rèidio-beò, agus adhartachadh furasta.

● Tha purrachd an t-sampall ìosal

Chan eil feum air bhìorasan no bacteria agus ceallan cultair a sgaradh.Faodar toraidhean amh DNA agus RNA a chleachdadh mar amplifiers.Faodar lorg meudachaidh DNA a chleachdadh gu dìreach le bhith a’ cleachdadh sampaill clionaigeach leithid fuil, lionn bodhaig, lionn nigheadaireachd casadaich, falt, ceallan, agus clò beò.

PCRduilgheadasan cumanta

● àicheil meallta, gun chòmhlan meudaichte

Am measg nam prìomh ìrean de fhreagairt PCR tha: ① ullachadh teamplaid nucleic acids, ② càileachd agus sònraichte primers, ③ càileachd enzymes ④ PCR suidheachaidhean cearcall.Bu chòir cuideachd lorg an adhbhar a sgrùdadh agus a sgrùdadh airson na ceanglaichean gu h-àrd.

Teamplaidean: ① Tha pròtain measgaichte anns an teamplaid, ② Anns an teamplaid tha inneal taq enzyme, ③ Chan eil am pròtain san teamplaid air a chuir às, gu sònraichte am pròtain buidhne anns a ’chromosome.⑤ Chan eil crìonadh searbhag niuclasach Deminer mionaideach.Nuair a tha càileachd enzymes agus primers math, chan eil còmhlan leudachaidh ann, a tha nas coltaiche ri làimhseachadh cnàmhaidh air sampallan.Tha rudeigin ceàrr air an teamplaid pròiseas às-tharraing searbhag niuclasach, mar sin gus fuasgladh cnàmhaidh èifeachdach agus seasmhach ullachadh, bu chòir an dòigh-obrach aige a bhith stèidhichte agus gun a bhith air atharrachadh gu neo-riaghailteach.

Neo-ghnìomhachd einnsein: bu chòir einnsein ùr no an dà chuid einnseanan sean is ùr a chleachdadh còmhla gus sgrùdadh a dhèanamh a bheil gnìomhachd an einnsein air chall no gu leòr, a’ leantainn gu àicheil meallta.Bu chòir a thoirt fa-near gu bheil Taq enzyme no ethidium bromide uaireannan air a dhìochuimhneachadh.

Primer: càileachd an primer, dùmhlachd an primer, agus a bheil dùmhlachd an dà phrìomhaire co-chothromach.Tha e na adhbhar cumanta airson fàilligeadh PCR no chan eil an còmhlan a tha a’ sìor fhàs air leth freagarrach agus buailteach a bhith sgaoilte.Tha duilgheadasan ann le càileachd primers cuid de na h-àireamhan baidse.Tha dùmhlachd àrd agus dùmhlachd ìosal aig an dà primer, ag adhbhrachadh leudachadh neo-chunbhalach ìosal-èifeachdais.Is iad na frith-tomhais: ① Tagh primer math airson aonadan a cho-chur.② Tha dùmhlachd an primer chan ann a-mhàin an urra ri luach OD, ach bidh e cuideachd a’ toirt aire do leaghan tùsail an primer gus electrophoresis gel siùcar agar a dhèanamh.Feumaidh sòn stiall primer a bhith ann, agus bu chòir soilleireachd an dà phrìomhaire a bhith cunbhalach san fharsaingeachd.Faodaidh crios, PCR fàiligeadh aig an àm seo, agus bu chòir a rèiteachadh leis an aonad synthesis primer.Ma tha primer àrd, tha an soilleireachd ìosal, agus feumaidh an dùmhlachd aige a bhith air a chothromachadh nuair a thèid a lagachadh.③ Bu chòir am primer a bhith air a phàigheadh ​​​​agus air a stòradh aig ìre àrd gus casg a chuir air grunn phàirtean reòta no fuarachaidh fad-ùine den fhrigeradair, a bheir air a’ primer a dhol sìos agus a dhol sìos.④ Tha dealbhadh an primer mì-reusanta, mar nach eil fad an primer gu leòr, agus tha an di cluster air a chruthachadh eadar na primers.

Mg2 + dùmhlachd: Tha buaidh mhòr aig dùmhlachd Mg2 + air èifeachdas àrdachadh PCR.Faodaidh cus dùmhlachd an gnè eile de leudachadh PCR a lughdachadh.Ma tha an dùmhlachd ro ìosal, nì toradh leudachaidh PCR eadhon fàilligeadh leudachaidh PCR às aonais a’ chòmhlan leudachaidh.

Atharrachadh meud freagairt: Is e an tomhas-lìonaidh a thathas a’ cleachdadh ann an leudachadh PCR 20ul, 30ul, agus 50ul no 100uL, tha an àireamh mhòr den tagradh airson leudachadh PCR air a shuidheachadh a rèir diofar adhbharan airson rannsachadh saidheansail agus deuchainn clionaigeach.Às deidh meudan beaga leithid 20ul a dhèanamh, feumar suidheachadh corda a dhèanamh nuair a bhios tu a ’dèanamh am meud, air neo bidh e a’ fàiligeadh.

Adhbharan fiosaigeach: Tha cruth-atharrachadh glè chudromach airson leudachadh PCR.Ma tha an teòthachd degeneration ìosal, tha an ùine degeneration goirid, tha e coltach gun tachair e ann an àicheil meallta;faodaidh teòthachd annealing ro ìosal adhbhrachadh le leudachadh neo-shònraichte agus lughdaich e èifeachdas leudachaidh sònraichte.Buaidh mhòr air a’ mheasgachadh de primers agus teamplaidean gus èifeachdas leudachaidh PCR a lughdachadh.Aig amannan feumar teirmean-tomhais àbhaisteach a chleachdadh gus caochlaidheachd, annealing agus teòthachd leudaichte a lorg anns a ’chucair leudachaidh no uisge-soluble, a tha mar aon de na h-adhbharan airson fàilligeadh an PCR.

Caochlaidhean sreath targaid: Ma thachras an t-sreath targaid, mùthadh no cuir às, tha an cothlamadh den prototype agus an teamplaid air a chur còmhla, no air sgàth dìth sreath targaid, caillidh am primer agus an teamplaid an t-sreath co-phàirteach, agus cha bhith an leudachadh PCR aige soirbheachail.

● Dearbhach meallta

Tha an còmhlan leudachaidh PCR a’ nochdadh co-chòrdail ris a’ chòmhlan sreath targaid, agus uaireannan tha a chòmhlan nas grinne agus nas àirde.

Chan eil dealbhadh primer iomchaidh: tha homologous aig an t-sreath leudachaidh taghte agus an t-sreath leudachaidh neo-adhbhar, agus mar sin nuair a tha leudachadh PCR, tha na toraidhean PCR leudaichte nan sreathan neo-adhbhar.Tha an t-sreath targaid ro ghoirid no tha am primer ro ghoirid, agus tha e buailteach a bhith meallta.Feumar ath-dhealbhadh.

Tar-thruailleadh sreath targaid no toraidhean leudachaidh: Tha dà adhbhar ann airson an truailleadh seo: An toiseach, tar-thruailleadh den genoma gu lèir no earrannan mòra, a’ leantainn gu nithean ceàrr.Faodar an seòrsa meallta dearbhach seo fhuasgladh leis na dòighean a leanas: Bi faiceallach agus socair rè obrachadh gus casg a chuir air an t-sreath targaid bho bhith air a thoirt a-steach don ghunna sampall no frasadh a-mach às an tiùb ceud-ghluasadach.A bharrachd air enzymes agus stuthan nach urrainn seasamh ri teòthachd àrd, bu chòir a h-uile inneal no uidheamachd a bhith air a dhì-ghalarachadh le cuideam àrd.Bu chòir na pìoban centrifugal agus na samples a chleachdadh aig aon àm.Nuair a bhios feum air, mus cuir thu sampallan, bidh an tiùb ath-bhualadh agus an ath-ghluasad fosgailte do ghathan ultraviolet gus an searbhag niuclasach a th’ ann a sgrios.San dàrna àite, mìrean beaga ann an truailleadh èadhair.Tha na mìrean beaga sin nas giorra na an t-sreath targaid, ach tha homology sònraichte aca.Faodaidh e bhith air a sgaradh le chèile.Às deidh cur ris na primers, faodar an toradh PCR a leudachadh, a dh ’adhbhraicheas cinneasachadh meallta meallta.Faodar a chleachdadh gus modh PCR nead a lughdachadh no a chuir às.

● A 'nochdadh còmhlan leudachaidh nonspecific

Tha na bannan a nochd às deidh leudachadh PCR neo-chunbhalach leis a’ mheud ris a bheil dùil, no mòr no beag, no aig an aon àm, no aig an aon àm, bannan leudachaidh sònraichte agus bannan leudachaidh neo-shònraichte.Is e nochdadh bannan neo-shònraichte: An toiseach, tha na primers neo-choileanta a’ cur ris an t-sreath targaid, no polymerization a’ primer gus di cluster a chruthachadh.Is e an dàrna fear gu bheil an dùmhlachd de ianan MG2 + ro àrd, gu bheil an teòthachd annealing ro ìosal, agus gu bheil an àireamh de chuairtean PCR co-cheangailte.San dàrna àite, càileachd agus meud nan enzymes.Gu math tric, tha einnseanan cuid de stòran buailteach do chòmhlan neo-shònraichte agus chan eil einnseanan an tobair eile a 'tachairt.Uaireannan bidh leudachadh neo-shònraichte de enzymes cuideachd a 'tachairt.Is iad na ceumannan frith-rathaid: ath-dhealbhadh tarraingeach ma tha sin riatanach.Lùghdaich an àireamh de enzyme no cuir an àite enzyme stòr eile.Lùghdaich an àireamh de bhun-sgoil, àrdaich an àireamh de theamplaidean gu h-iomchaidh, agus lughdaich an àireamh de chuairtean.Àrdaich an teòthachd annealing gu ceart no cleachd an dà dhòigh puing teòthachd (93 ° C degeneration, annealing agus leudachadh aig timcheall air 65 ° C).

● Seall barrach sgeadaich no teip smear

Uaireannan bidh e coltach gu bheil leudachadh PCR air a chuir an sàs no air a shlaodadh no air crios coltach ri brat-ùrlair.Air an adhbhar sin, air sgàth cus de enzymes no droch chàileachd an enzyme, tha an dùmhlachd dNTP ro àrd, tha an dùmhlachd Mg2 + ro àrd, tha an teòthachd annealing ro ìosal, agus tha an àireamh de chuairtean cus.Is iad na ceumannan frith-rathaid: ① Lùghdaich an àireamh de enzymes, no atharraich enzyme stòr eile.② Lùghdaich dùmhlachd dNTP ③ Lùghdaich gu ceart dùmhlachd Mg2+.④ Meudaich an àireamh de theamplaidean agus lughdaich an àireamh de chuairtean.

Bathar Co-cheangailte

Gaisgeach PCR (With Dye)

◮ Dìlseachd nas àirde: 6 tursan nas àirde na an enzyme Taq àbhaisteach;

◮ Astar leudachaidh nas luaithe

◮ Barrachd sùbailteachd teamplaid

◮ Èifeachdas leudachaidh nas àirde

◮ Tha fulangas àrainneachd nas làidire: air a chuir aig 37 ° C airson seachdain, a’ cumail barrachd air 90% gnìomhachd;

◮ Tha gnìomhachd DNA polymerase 5’→3’ aige agus gnìomhachd exonuclease 5’→3’, às aonais gnìomhachd exonuclease 3’→ 5’.

PCR Easy (With Dye)

Tha an siostam ath-bhualadh sònraichte agus Taq DNA Polymerase àrd-èifeachdais a’ dèanamh gu bheil èifeachdas leudachaidh nas àirde, sònrachas agus cugallachd aig freagairt PCR.

RT-qPCR Easy (One Step) -SYBR Green I

◮ Bidh pasgan aon-cheum a’ dèanamh tar-sgrìobhadh air ais agus qPCR dà ath-bhualadh san aon phìob, cha leig thu leas ach teamplaid RNA, primers PCR sònraichte agus ddH gun RNase a chur ris₂O.

◮ Faodaidh an t-inneal mion-sgrùdadh cainneachdail a dhèanamh gu luath agus gu h-èifeachdach air RNA viral no lorg RNA.

◮ Bidh an cromag a’ cleachdadh ath-aithris tar-sgrìobhaidh cùil Foregene gun samhail agus Foregene HotStar Taq DNA Polymerase còmhla ri siostam ath-bhualadh sònraichte gus èifeachdas leudachaidh agus sònrachas an ath-bhualadh adhartachadh gu h-èifeachdach.

◮ Tha an siostam ath-bhualadh leasaichte a’ toirt air an ath-bhualadh mothachadh lorgaidh nas àirde, seasmhachd teirmeach nas làidire, agus fulangas nas fheàrr.

◮ RT-qPCR Furasta^TM(Aon cheum) -SYBR Green I kit a’ tighinn le dath fiosrachaidh a-staigh ROX, a dh’ fhaodar a chleachdadh gus cuir às do chùl-fhiosrachadh chomharran agus mearachdan comharran eadar tobraichean, a tha goireasach dha luchd-ceannach a chleachdadh ann an diofar mhodalan de dh’ ionnstramaidean cainneachdail PCR.

RT furasta^TMII (Master Premix airson synthesis cDNA a’ chiad dual airsonPCR fìor-ùine)

-Comas èifeachdach air gDNA a thoirt air falbh, a bheir air falbh gDNA san teamplaid taobh a-staigh 2 mhionaid.

- Siostam tar-sgrìobhaidh cùil èifeachdach, cha toir e ach 15 mionaidean gus synthesis a’ chiad dual cDNA a chrìochnachadh.

-Teamplaidean iom-fhillte: faodar teamplaidean le susbaint àrd GC agus structar àrd-sgoile iom-fhillte a thionndadh air ais le àrd èifeachdas.

-Siostam tar-sgrìobhaidh cùil àrd-chugallachd, faodaidh teamplaidean ìre pg cDNA àrd-inbhe fhaighinn cuideachd.

-Tha seasmhachd teirmeach àrd aig an t-siostam tar-sgrìobhaidh cùil, is e an teòthachd ath-bhualadh as fheàrr 42 ℃, agus tha coileanadh tar-sgrìobhaidh math aige fhathast aig 50 ℃.