Is e PCR an teicneòlas meudachaidh searbhag niuclasach as fharsainge agus tha e air a chleachdadh gu farsaing air sgàth cho cugallach ‘s a tha e.Ach, tha PCR a’ feumachdainn dì-nàdurachadh teirmeach a-rithist agus chan urrainn dha faighinn cuidhteas na crìochan a thaobh a bhith an urra ri ionnstramaidean agus uidheamachd, a tha a’ cuingealachadh a chuir an sàs ann an deuchainnean clionaigeach clionaigeach.

Bho thràth anns na 1990n, tha mòran deuchainn-lannan air tòiseachadh a’ leasachadh teicneòlas àrdachadh teothachd seasmhach nach eil feumach air dì-nàdarachadh teirmeach.A-nis tha iad air teicneòlas leudachaidh isothermal meadhan-lùb a leasachadh, teicneòlas leudachaidh isothermal ath-nuadhachadh dualan, teicneòlas leudachaidh isothermal cearcall rollaidh, agus eisimeileachd air sreath searbhag niuclasach.Teicneòlas leudachaidh isothermal agus teicneòlasan eile. 

Lleudachadh isothermal le oop-mediated

Tha am prionnsapal leudachaidh stèidhichte air gu bheil DNA ann an staid co-chothromachd fiùghantach aig timcheall air 65 ° C.Nuair a bhios primer sam bith ann am paidhir bunaiteach agus air a leudachadh chun phàirt taiceil de DNA dà-shreath, bidh an iallan eile a’ dealachadh agus a’ fàs aon-shreath.

Aig an teòthachd seo, bidh DNA a’ cleachdadh 4 primers sònraichte gus a bhith an urra ri DNA polymerase gluasad dualan gus toirt air synthesis DNA gluasad dualan fèin-chuairteachadh gu leantainneach.

Dèan cinnteach an toiseach na 6 roinnean sònraichte F3, F2, F1, B1, B2, B3 air a’ ghine targaid, agus an uairsin dealbhaich 4 primers stèidhichte air na 6 roinnean sònraichte sin (mar a chithear san fhigear gu h-ìosal):

Tha am primer a-staigh air adhart (FIP) air a dhèanamh suas de F1c agus F2.

Tha am primer air ais a-staigh (BIP) air a dhèanamh suas de B1c agus B2, agus tha TTTT air a chleachdadh mar spacer sa mheadhan.

Tha na primers a-muigh F3 agus B3 air an dèanamh suas de roinnean F3 agus B3 air a’ ghine targaid.

Anns an t-siostam ath-bhualadh LAMP, tha dùmhlachd an primer a-staigh grunn thursan nas àirde na an primer a-muigh.Tha am primer a-staigh air a chur còmhla an toiseach leis an dualan teamplaid gus dualan co-phàirteach a cho-chur gus dualan dùbailte DNA a chruthachadh.Às deidh sin, tha am primer a-muigh air a chur còmhla ris an dualan teamplaid gus dualan dùbailte DNA a chruthachadh.Fo ghnìomhachd BstDNA polymerase, tha an iallan co-phàirteach air a cho-chur leis a’ primer a-staigh air a leigeil ma sgaoil.Às deidh sreath de ath-bheachdan, tha an iallan co-phàirteach mu dheireadh a’ cruthachadh aon iallan DNA le structar dumbbell.

Tha an structar dumbbell DNA singilte dualan fhèin air a chleachdadh mar theamplaid gus structar lùb-lùb eadar-ghluasaid DNA a chruthachadh le ceann fosgailte.Bidh na primers a-staigh agus a-muigh a’ stiùireadh structar lùb-gas eadar-amail DNA gus a dhol tro ath-ghluasadan dualan is leudachaidh, agus mu dheireadh a’ cruthachadh iomadh structar lùb-gas le faid eadar-dhealaichte.measgachadh DNA.

Buannachdan agus eas-bhuannachdan leudachadh isothermal le meadhan lùb

Buannachdan LAMP:

(1) Èifeachdas leudachaidh àrd, a dh'fhaodas 1-10 leth-bhreac den ghine targaid àrdachadh taobh a-staigh 1h, agus tha an èifeachdas leudachaidh 10-100 uair nas àirde na PCR àbhaisteach.

(2) Tha an ùine freagairt goirid, tha an sònrachas làidir, agus chan eil feum air uidheamachd sònraichte.

Eas-bhuannachdan LAMP:

(1) Tha na riatanasan airson primers gu sònraichte àrd.

(2) Chan urrainnear an toradh leudaichte a chleachdadh airson clonadh agus sreath, ach chan urrainnear a chleachdadh ach airson breithneachadh.

(3) Air sgàth cho cugallach ‘s a tha e, tha e furasta aerosols a chruthachadh, ag adhbhrachadh nithean ceàrr agus a’ toirt buaidh air toraidhean deuchainn.

Sleudachadh gluasad gluasad

Tha leudachadh gluasad dualan (SDA) na dhòigh leudachaidh DNA isothermal in vitro stèidhichte air ath-bhualadh enzymatic a mhol an sgoilear Ameireaganach Walker an toiseach ann an 1992.

Tha siostam bunaiteach SDA a’ toirt a-steach endonuclease cuibhreachaidh, DNA polymerase le gnìomhachd gluasad dualan, dà phaidhir de phrìomhairean, dNTPs, agus ionsan calcium agus magnesium agus siostaman bufair.

Tha prionnsapal leudachadh gluasad dualan stèidhichte air an t-sreath aithneachaidh endonuclease cuibhreachaidh a chaidh atharrachadh gu ceimigeach aig gach ceann den DNA targaid.Bidh an endonuclease a’ fosgladh a’ bheàirn anns an dualan DNA aig an làrach aithneachaidh aige, agus tha an DNA polymerase a’ leudachadh a’ bheàrn 3 ′ Crìoch agus a’ cuir an ath shreath DNA an àite.

Faodar na sreathan singilte de DNA a chaidh an àite a chur còmhla ri primers agus an leudachadh gu iallan dùbailte le DNA polymerase.Tha am pròiseas seo air ath-aithris gu leantainneach, gus am bi an t-sreath targaid air a mheudachadh gu h-èifeachdach.

Buannachdan agus eas-bhuannachdan teicneòlas leudachaidh gluasad dualan

Buannachdan SDA:

Tha an èifeachdas leudachaidh àrd, tha an ùine freagairt goirid, tha an sònrachas làidir, agus chan eil feum air uidheamachd sònraichte.

Eas-bhuannachdan an SDA:

Chan eil na toraidhean èideadh, agus bidh cuid de thoraidhean aon-shreath agus dà-shreath an-còmhnaidh air an toirt a-mach ann an cearcall SDA, agus tha e do-sheachanta gun tachair earball nuair a lorgar e le electrophoresis.

Rleudachadh cearcall olling

Thathas a’ moladh leudachadh cearcall rollaidh (RCA) le bhith a’ tarraing air an dòigh airson DNA a chopaigeadh bho fhàs-bheairtean pathogenic le cearcall rollaidh.Tha e a’ toirt iomradh air cleachdadh DNA cruinn aon-shreath mar theamplaid aig teòthachd sheasmhach, agus DNA polymerase sònraichte (leithid Phi29) ) Fo ghnìomhachd synthesis DNA cearcallach gus leudachadh air a’ ghine targaid a choileanadh.

Faodar RCA a roinn ann an leudachadh sreathach agus leudachadh exponential.Faodaidh èifeachdas RCA sreathach ruighinn 10⁵amannan, agus faodaidh èifeachdas RCA exponential ruighinn 10⁹amannan.

Eadar-dhealachadh sìmplidh, mar a chithear san fhigear gu h-ìosal, tha leudachadh sreathach a a’ cleachdadh 1 primer a-mhàin, leudachadh exponential b le 2 primers.

Canar RCA sreathach cuideachd ri primer singilte RCA.Bidh primer a’ ceangal ri DNA cruinn agus air a leudachadh le gnìomh DNA polymerase.Tha an toradh na shreath shingilte sreathach le àireamh mhòr de shreathan ath-aithris mìltean de thursan fad aon lùb.

Leis gu bheil toradh RCA sreathach an-còmhnaidh ceangailte ris a ’chiad primer, tha suidheachadh furasta a’ chomharra na phrìomh bhuannachd.

RCA eas-chruthach, ris an canar cuideachd leudachadh Hyper branched HRCA (RCA branrach Hyper), ann an RCA eas-chruthach, bidh aon primer a’ leudachadh toradh RCA, bidh an dàrna primer a ’dol thairis air toradh RCA agus a’ leudachadh, agus tha an t-àite mu thràth ceangailte ri toradh RCA.

Na buannachdan agus na h-eas-bhuannachdan a tha ann an leudachadh cearcall nucleic acid

Buannachdan RCA:

Àrd cugallachd, deagh shònrachas agus furasta obrachadh.

Eas-bhuannachdan an RCA:

Duilgheadasan cùl-fhiosrachaidh rè lorg chomharran.Rè ath-bhualadh RCA, faodaidh an probe glas-ghlas neo-chuairtichte agus an teamplaid DNA no RNA den probe gun cheangal cuid de chomharran cùl-fhiosrachaidh a ghineadh. 

Nleudachadh stèidhichte air sreath ucleicacid

Is e teicneòlas ùr a th’ ann an leudachadh stèidhichte air sreath searbhag niuclasach (NASBA) a chaidh a leasachadh air bunait PCR.Is e leudachadh searbhag niuclasach leantainneach agus isothermal a th’ ann air a stiùireadh le paidhir de phrìomhairean le sreath adhartachaidh T7.Faodaidh an teicneòlas an teamplaid RNA àrdachadh timcheall air 109 uair ann an timcheall air 2 uair, a tha 1000 uair nas àirde na an dòigh àbhaisteach PCR agus nach eil feumach air uidheamachd sònraichte.

Chaidh an teicneòlas seo a chleachdadh airson breithneachadh luath air galairean cho luath ‘s a nochd e, agus tha mòran chompanaidhean an-dràsta a’ cleachdadh an dòigh seo ann an innealan lorg RNA.

Ged a dh’fhaodas leudachadh RNA cuideachd teicneòlas PCR tar-sgrìobhaidh cùil a chleachdadh, tha na buannachdan aige fhèin aig NASBA: faodar a dhèanamh fo chumhachan teòthachd an ìre mhath seasmhach, agus tha e nas seasmhaiche agus nas cruinne na teicneòlas PCR traidiseanta.

Tha an ath-bhualadh aig 41 ceum Celsius agus feumar AMV (bhìoras myeloblastosis avian) air ais transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase agus paidhir de primers airson a chrìochnachadh.

Tha am pròiseas a 'gabhail a-steach sa mhòr-chuid:

Tha an t-sreath adhartach den neach-adhartachaidh T7 anns an t-sreath adhartach.Rè an ath-bhualadh, bidh am primer air adhart a 'ceangal ris an t-sreath RNA agus tha e air a chatalachadh leis an enzyme AMV gus dualan dùbailte DNA-RNA a chruthachadh.

Bidh RNase H a’ cnàmhadh an RNA anns an dual dà-chonnaidh agus a’ cumail an DNA aon-shreath.

Fo ghnìomhachd an primer cùil agus an enzyme AMV, thèid dualan dùbailte DNA anns a bheil an t-sreath adhartachaidh T7 a chruthachadh.

Fo ghnìomhachd T7 RNA polymerase, tha am pròiseas tar-sgrìobhaidh air a chrìochnachadh agus tha mòran de RNA targaid air a thoirt a-mach.

Buannachdan NASBA:

(1) Tha sreath adhartachaidh T7 aig an primer aige, ach chan eil sreath adhartachaidh T7 aig an DNA dà-shreath cèin agus chan urrainnear a mheudachadh, agus mar sin tha sònrachas agus cugallachd àrd aig an teicneòlas seo.

(2) Bidh NASBA gu dìreach a’ toirt a-steach am pròiseas tar-sgrìobhaidh cùil a-steach don ath-bhualadh leudachaidh, a’ giorrachadh an ùine freagairt.

Eas-bhuannachdan NASBA:

(1) Tha na pàirtean freagairt nas iom-fhillte.

(2) Tha feum air trì seòrsaichean enzyman gus am bi an ath-bhualadh a’ cosg nas àirde.