Tha Real Time PCR, ris an canar cuideachd PCR cainneachdail no qPCR, na dhòigh airson sgrùdadh agus sgrùdadh fìor-ùine air toraidhean leudachaidh PCR.
Leis gu bheil na buannachdan aig PCR cainneachdail airson obrachadh sìmplidh, luath agus goireasach, cugallachd àrd, ath-aithris math, agus ìre truailleadh ìosal, tha e air a chleachdadh gu farsaing ann an deuchainnean meidigeach, measadh èifeachd dhrogaichean, sgrùdadh abairt gine, rannsachadh transgenic, lorg gine, lorg pathogen, lorg bheathaichean is phlanntaichean., deuchainn bìdh agus raointean eile.
Mar sin, ge bith co-dhiù a tha thu an sàs ann an rannsachadh bunaiteach ann an saidheansan beatha, no luchd-obrach chompanaidhean cungaidh-leigheis, companaidhean tuathanachas bheathaichean, companaidhean bìdh, no eadhon luchd-obrach sgrùdadh fàgail-inntrigidh agus bureaus cuarantain, roinnean sgrùdaidh àrainneachd, ospadalan agus aonadan eile, bidh thu barrachd no nas lugha fosgailte do No feumaidh fios a bhith agad air an eòlas air maighstireachd cainneachdail PCR.

Prionnsabal PCR fìor-ùine

Is e fìor-ùine a th’ ann am PCR an dòigh anns am bi stuthan flùraiseach air an cur ris an t-siostam ath-bhualadh PCR, agus thathas a’ cumail sùil air dian chomharran fluorescence ann am pròiseas ath-bhualadh PCR ann an àm fìor le inneal PCR cainneachdail, agus mu dheireadh tha an dàta deuchainneach air a mhion-sgrùdadh agus air a phròiseasadh.

【Curve leudachaidh】an lùb a tha a’ toirt cunntas air pròiseas fiùghantach PCR.Chan e lùb leudachaidh PCR a th’ ann an lùb àbhaisteach àbhaisteach, ach lùb sigmoid.

[Ìre àrd-ùrlar den lùb leudachaidh]Le àrdachadh anns an àireamh de chuairtean PCR, neo-ghnìomhachd DNA polymerase, ìsleachadh dNTPs agus primers, agus casg air ath-bhualadh synthesis leis an ath-bhualadh pyrophosphate fo-thoradh, msaa, chan eil am PCR an-còmhnaidh a’ leudachadh gu h-obann., agus mu dheireadh thèid e a-steach air àrdchlàr.

[Roinn Fàs Exponential de lùb leudachaidh]Ged a tha ìre an àrdchlàr ag atharrachadh gu mòr, ann an roinn sònraichte den roinn fàis exponential den lùb leudachaidh, tha an ath-sheasmhachd fìor mhath, a tha glè chudromach airson mion-sgrùdadh cainneachdail air PCR.

[Luach stairsnich agus luach Ct]Shuidhich sinn an luach crìche airson lorg fluorescence aig an t-suidheachadh iomchaidh ann an raon fàis eas-chruthach an lùb leudachaidh, is e sin luach na stairsnich (Trannsa).Is e an eadar-ghearradh de luach na stairsnich agus an lùb leudachaidh an luach Ct, is e sin, tha an luach Ct a’ toirt iomradh air an àireamh de chearcaill (Cearcall Tìre) nuair a ruigear luach na stairsnich.

Tha an graf gu h-ìosal a’ sealltainn gu soilleir an dàimh eadar loidhne stairsnich agus lùb leudachaidh, stairsneach agus luach Ct.

【Ciamar a thomhas?】

Tha e air a dhearbhadh le teòiridh matamataigeach gu bheil dàimh loidhneach neo-dhìreach aig luach Ct le logarithm an àireamh de theamplaidean tùsail.Bidh Real Time PCR a’ cumail sùil air toraidhean leudachaidh PCR ann an àm fìor agus gan tomhas aig ìre leudachaidh eas-chruthach.

Airson gach cearcall de PCR, mheudaich an DNA gu mòr le 2 uair, agus cha b’ fhada gus an ruigeadh e àrdchlàr.

A’ gabhail ris gur e A₀ , às deidh n cearcallan, faodar an tomhas teòiridheach de thoradh DNA a chuir an cèill mar:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

An uairsin, mar as motha a tha an t-suim DNA tùsail A 0, is ann as luaithe a ruigeas an ìre den toradh meudaichte an luach lorgaidh An , agus an àireamh de chuairtean nuair a ruigeas iad An tha luach Ct.Is e sin, mar as motha a tha an t-suim DNA tùsail A 0, is ann as tràithe a bhios an lùb leudachaidh a’ binneanan, agus mar sin bidh an àireamh de chuairtean n a tha a dhìth nas lugha.

Bidh sinn a’ dèanamh caolachadh caisead air an ìre cruinneachaidh aithnichte agus ga chleachdadh mar theamplaid airson Real Time PCR, agus gheibhear sreath de lùban leudachaidh aig amannan co-ionann ann an òrdugh tòiseachadh suim DNA bho barrachd gu nas lugha.A rèir an dàimh sreathach eadar luach Ct agus logarithm an àireamh de theamplaidean tòiseachaidh, aFaodar [lùb àbhaisteach] a chruthachadh.

Le bhith a’ cur luach Ct an t-sampall le dùmhlachd neo-aithnichte a-steach don lùb àbhaisteach, gheibhear an àireamh teamplaid tùsail den sampall le dùmhlachd neo-aithnichte, is e sin prionnsapal cainneachdail Real Time PCR.

Modh lorg PCR fìor-ùine

Bidh Real Time PCR a’ lorg thoraidhean leudachaidh PCR le bhith a’ lorg cho dian sa tha fluorescence san t-siostam ath-bhualadh.

Prionnsabal dòigh freumhachadh dath flùraiseach】

Dathan flùraiseach, leithid TB Green ® , ceangal gu neo-shònraichte ri DNA dà-shreath ann an siostaman PCR agus fluoresce nuair a thèid an ceangal.

Mheudaich an dian fluorescence san t-siostam ath-bhualadh gu mòr le àrdachadh ann an cearcallan PCR.Le bhith a’ lorg an dian fluorescence, faodar sùil a chumail air an ìre de mheudachadh DNA san t-siostam ath-bhualadh ann an àm fìor, agus an uairsin faodar tuairmse a dhèanamh air meud an teamplaid tòiseachaidh san sampall.

【Prionnsabal dòigh sgrùdaidh fluorescent】

probe fluorescentIs e sreath searbhag niuclasach a th’ ann le buidheann flùraiseach aig a’ cheann 5 ′ agus buidheann quenching aig ceann 3 ′, a dh’ fhaodas ceangal gu sònraichte ris an teamplaid.Nuair a bhios an probe slàn, thèid an fluorescence a thèid a sgaoileadh leis an fluorophore a chuir às leis a’ bhuidheann quenching agus chan urrainn dha fluoresge.Nuair a thèid an probe a bhriseadh, bidh an stuth flùraiseach a 'dol às a chèile agus a' leigeil a-mach fluorescence.

Tha probe flùraiseach air a chur ris an fhuasgladh freagairt PCR.Rè a 'phròiseas annealing, bidh an probe flùraiseach a' ceangal ri suidheachadh sònraichte an teamplaid.Tron phròiseas leudachaidh, faodaidh gnìomhachd exonuclease 5 ′ → 3 ′ den enzym PCR an probe fluorescent a dhì-fhilleadh leis an teamplaid, agus tha an stuth flùraiseach air a sgaradh gus fluorescence a leigeil ma sgaoil.Le bhith a’ lorg dèinead fluorescence an probe san t-siostam ath-bhualadh, faodar adhbhar sùil a chumail air meud meudachaidh an toraidh PCR.

【Taghadh de dhòigh lorg fluorescence】

Ma thèid a chleachdadh airson eadar-dhealachadh a dhèanamh air sreathan le homology àrd agus lorg PCR ioma-fhillte leithid mion-sgrùdadh clò-sgrìobhaidh SNP, chan urrainnear an dòigh sgrùdaidh fluorescent a chuir na àite.
Airson deuchainnean PCR Real Time eile, faodar dòigh chimera flùraiseach sìmplidh, furasta agus aig prìs ìosal a chleachdadh.

probes Sònrachas làidir, comasach air ioma-fhillte PCR

Dìth

Riatanasan sònraichte airson leudachadh;

chan urrainnear PCR ioma-fhillte a dhèanamhFeumar probes sònraichte a dhealbhadh, cosgais àrd;

uaireannan tha dealbhadh probe duilich

Bathar co-cheangailte: