1. Lorg absorbance fuasgladh RNA
Tha neo-làthaireachd aig 280, 320, 230, agus 260 nm a’ riochdachadh luachan searbhag niuclasach, cùl-raon (iomallachd fuasglaidh), dùmhlachd salainn, agus stuth organach leithid pròtain, fa leth.San fharsaingeachd dìreach thoir sùil air OD260/OD280 (Co-mheas, R).Nuair a tha 1.8 ~ 2.0, tha sinn den bheachd gum faodar gabhail ri truailleadh pròtain no stuth organach eile ann an RNA, ach bu chòir a thoirt fa-near, nuair a thèid Tris a chleachdadh mar bufair gus an sùghadh a lorg, gum faodadh an luach R a bhith nas àirde na 2 (mar as trice bu chòir dha a bhith <2.2).Nuair a tha R<1.8, truailleadh pròtain no stuth organach eile anns an fhuasgladh nas fhollaisiche, agus faodar mar a thachair don RNA a dhearbhadh a rèir feumalachdan.Nuair a tha R> 2.2, tha e a’ ciallachadh gu bheil RNA air a h-uisgeachadh gu searbhag niuclasach singilte.
Pàtran 2.Electrophoretic de RNA
San fharsaingeachd, thathas a ’cleachdadh gel dì-nàdurrach airson electrophoresis RNA, ach mura h-eil e ach airson càileachd RNA a lorg, chan eil feum air gel dì-nàdurrach, agus faodar gel agarose àbhaisteach a chleachdadh.Is e adhbhar electrophoresis ionracas bannan 28S agus 18S agus an co-mheas a lorg, no ionracas smear mRNA.San fharsaingeachd, ma tha na bannan 28S agus 18S soilleir, soilleir, agus geur (a 'toirt iomradh air oirean nan còmhlan soilleir), agus gu bheil soilleireachd 28S còrr is dà uair nas àirde na a' chòmhlan 18S, tha sinn den bheachd gu bheil càileachd an RNA math.
Is e an fheadhainn gu h-àrd an dà dhòigh a bhios sinn a’ cleachdadh gu cumanta, ach chan urrainn dha gin den dà dhòigh sin innse dhuinn gu soilleir a bheil RNase air fhàgail ann am fuasgladh RNA.Ma tha glè bheag de RNase anns an fhuasgladh, tha e doirbh dhuinn a lorg leis an dòigh gu h-àrd, ach tha a 'mhòr-chuid de na h-ath-bheachdan enzymatic an dèidh sin air an dèanamh aig ìre nas àirde na 37 ceum agus airson ùine mhòr.San dòigh seo, ma tha glè bheag de RNase ann am fuasgladh RNA, bidh àrainneachd agus ùine gu math iomchaidh ann airson an dreuchd a chluich anns na deuchainnean às deidh sin, agus gu dearbh bidh an deuchainn fuar aig an àm seo.Gu h-ìosal bheir sinn a-steach dòigh a dhearbhas a bheil RNase air fhàgail ann am fuasgladh RNA.
3. Deuchainn gleidheadh teas
A rèir dùmhlachd an t-sampall, tarraing dà RNA 1000 ng RNA bhon fhuasgladh RNA agus cuir e ri tiùb centrifuge 0.5 ml, agus cuir ris le bufair pH 7.0 Tris gu tomhas-lìonaidh iomlan de 10 ul, agus an uairsin seulaich caip an tiùba.Cuir fear dhiubh ann an amar uisge le teòthachd cunbhalach aig 70 ° C agus cùm e blàth airson 1 h.Tha am pàirt eile air a stòradh ann am fuaradair -20 ° C airson 1 h.Nuair a tha an ùine seachad, thoir air falbh an dà shampall airson electrophoresis.Às deidh an electrophoresis a chrìochnachadh, dèan coimeas eadar bannan electrophoretic an dà.Ma tha bannan an dithis cunbhalach no nach eil eadar-dhealachadh mòr aca (gu dearbh, bidh na bannan aca cuideachd a ’coinneachadh ris na cumhachan ann am modh 2), tha e a’ ciallachadh nach eil truailleadh RNase air fhàgail anns an fhuasgladh RNA, agus tha càileachd an RNA fìor mhath.Air an làimh eile, ma tha an sampall a chaidh a bhrosnachadh aig 70 ° C a ’nochdadh truailleadh follaiseach, tha e a’ nochdadh gu bheil truailleadh RNase ann am fuasgladh RNA.
2 Dòighean agus dòighean deuchainneach airson às-tharraing RNA
Is iad na duilgheadasan a choinnicheas sinn gu tric nuair a bhios sinn a’ toirt a-mach RNA: (1) Tha toradh RNA ìosal;(2) Tha droch thruailleadh salainn aig RNA;(3) Tha fìor thruailleadh fuasglaidh organach aig RNA;(4) sampall truailleadh agus duilgheadasan eile
1. Ath-bheachdan às-tharraing RNA iomlan air an cleachdadh gu cumanta
Is e an dòigh guanidine isothiocyanate agus an dòigh Trizol na dòighean as cumanta airson RNA iomlan a thoirt a-mach à figheagan bheathaichean agus ceallan bheathaichean.Tha e gu sònraichte freagarrach airson sampallan beaga agus maothran a tha gu sònraichte duilich a thoirt a-mach, leithid toirt a-mach RNA iomlan bho chraiceann coineanach agus clò ceangail bheathaichean;A bharrachd air an sin, faodar Trizol, mar inneal lysis adhbhar coitcheann, a chleachdadh cuideachd airson a bhith a’ toirt a-mach stuthan planntrais, bacteria, fungasan agus stuthan eile.Airson stuthan planntrais anns a bheil polysaccharides agus polyphenols, leithid camellia oleifera, duilleagan tì, sìol ròin, msaa, faodar an dòigh CTAB a chleachdadh cuideachd airson RNA iomlan a thoirt a-mach.
Mar dhòigh àbhaisteach, tha fèill mhòr air an dòigh dà-colbh cuideachd air sgàth an obrachaidh teòthachd àbhaisteach aige, chan eil feum air RNase a chuir ris, agus sàbhailteachd - gun chloroform, phenols agus ath-bheachdan organach eile airson às-tharraing.(bathar air a mholadh )
2. Tarraing RNA iomlan bho fhigheagan bheathaichean
(1) Feuch ri clò ùr a thaghadh, mura h-eil e ùr (taobh a-staigh trì mìosan nas fheàrr - 80 ℃ fuaradair no reòta ann an naitridean leaghan. Nuair a bhios tu a’ gearradh clò, na gearraich gu dìreach aig teòthachd an t-seòmair, bi cinnteach gun cuir thu air a ’bhogsa deighe e, feuch ri reothadh is leaghadh a sheachnadh.
(2) Cleachd siosar glan agus clò-bhualadair airson pìos beag clò a ghearradh, feuch ris a’ phàirt mheadhanach den stuth a ghearradh nuair a bhios tu a’ gearradh an t-sampall, no an toiseach gearraich am pìos mòr clò bhon mheadhan, agus an uairsin gearraich an sampall aig an t-suidheachadh incision ùr.Bu chòir an stuth a chaidh a thoirt air falbh a bhith air a shreapadh gu h-iomlan, cuir an clò shredded a-steach do phìob EP gun RNase, cuir an lysate ris, bu chòir an clò shredded a bhith làn fosgailte don lysate, agus ullaich airson homogenization.
(3) Airson stuthan àbhaisteach, tagh clòthan meud bean mung (30-60 mg) airson homogenization.Ma tha tòrr pròtain, geir, no maothran tiugh snàithleach leithid grùthan anns na figheagan, àrdaich no lughdaich gu h-iomchaidh na tha de stuth gearraidh (roghainneil) Tagh 10 ~ 20 mg).
(4) Ma thèid fèithean èisg, feòil shrimp, sleamhainn agus stuthan eile le susbaint uisge àrd a thoirt a-mach, bu chòir an tomhas sampall àrdachadh gu h-iomchaidh (100-200 mg air a mholadh).
(5) Ma cheadaicheas na cumhaichean, faodar an stuth beathach a thoirt a-mach gu dìreach às deidh dha a bhith homogenized le homogenizer clò àrd trannsa, mura h-eil uidheamachd mar sin ann.
(6) Feumar an RNA a gheibhear às deidh an tarraing mu dheireadh a chuir air a ’bhogsa deighe sa bhad gus lughdachadh RNA a lughdachadh.
3. Animal cealla RNA às-tharraing
(1) Ceallan crochaidh: centrifuge gu dìreach agus cuir às don mheadhan, nigh le PBS sterile airson 1-2 uair, an uairsin cuir stad air le tomhas iomchaidh de PBS, agus an uairsin cuir lysate airson lysis.Na cuir an lysate gu dìreach ris na ceallan sèididh às deidh dhut an leaghan a thoirt air falbh gu tur.Bidh seo ag adhbhrachadh gum bi am pasgan histone a thèid a leigeil ma sgaoil às deidh dha na ceallan lysed air an t-sreath a-muigh cumail ris an taobh a-muigh de na ceallan sèididh, agus mar sin a’ cuingealachadh conaltradh nan ceallan taobh a-staigh an pellet leis an lysate., a 'ciallachadh gu bheil lysis cealla neo-choileanta agus lùghdachadh ann an toradh RNA.
(2) Ceallan a tha leth-ghlèidhte no nach eil a’ cumail gu teann: Às deidh dhut am meadhan a chuir air falbh, nigh le PBS airson 1-2 uair, an uairsin cuir a-steach gu dìreach meud iomchaidh de PBS agus sèididh a’ mhias cultair le pìobaid no gunna gus na ceallan a shèideadh, agus an gluasad gu ceallan gun RNA.Cuir an lysate ris an tiùb EP den enzyme airson a thoirt a-mach.
(3) Ceallan ceangailte: feumar an cnàmhadh le trypsin an toiseach, an uairsin a chruinneachadh a-steach do phìoban EP gun RNase, centrifuged gus an supernatant a thoirt air falbh, a nighe 1-2 uair le PBS gus cus trypsin a thoirt air falbh, agus ath-chuir air ais le tomhas iomchaidh de PBS An uairsin lean air adhart chun cheum às-tharraing.
4. Lusan às-tharraing RNA
Tha stuthan planntrais beairteach ann an todhar phenolic, no beairteach ann am polysaccharides, no tha cuid de mheatabolites àrd-sgoile neo-aithnichte, no tha gnìomhachd àrd de RNase aca.Tha na stuthan sin air an cur còmhla gu teann le RNA às deidh lysis cealla gus iom-fhilltean neo-sholabailte no precipitates colloidal a chruthachadh, a tha duilich a thoirt air falbh.Mar sin, nuair a bheir sinn a-mach clò planntrais, feumaidh sinn pasgan a thaghadh airson lusan.Faodaidh an lysate anns a ’phiseag fuasgladh èifeachdach a dhèanamh air na duilgheadasan a thaobh oxidation furasta de polyphenols agus dealachadh todhar polysaccharide agus searbhag niuclasach.
(Airson às-tharraing RNA planntrais polysaccharide polyphenol, toraidhean air am moladh:
(1) Bu chòir craiceann, pronnadh, sìol, duilleagan, msaa den lus a bhith làn talmhainn ann an mortar.Rè a 'phròiseas bleith, bu chòir naitridean leaghaidh a bhith air an ath-lìonadh ann an àm gus nach leaghadh an sampall.Bu chòir an sampall talmhainn a chuir gu sgiobalta ris an lysate agus a chrathadh gus truailleadh RNA a sheachnadh.
(2) Airson sampallan làn fiber leithid rus agus duilleagan cruithneachd, bu chòir an ìre às-tharraing a lughdachadh gu h-iomchaidh, air neo cha bhith am bleith agus an lysis clò coileanta, agus mar thoradh air sin thig toradh ìosal de RNA a chaidh a thoirt a-mach.
(3) Airson stuthan planntrais le susbaint uisge àrd, leithid measan pomegranate, measan watermelon, measan peach, msaa, bu chòir meud an sampall àrdachadh gu h-iomchaidh (tha 100-200 mg roghainneil).
(4) Mar as trice thathas a’ moladh clò-bhualaidhean planntrais, leithid duilleagan planntrais, riosan, measan cruaidh agus stuthan eile a bhith a’ cleachdadh nitrigin liùlach gus na grìtheidean ann am mortar a bhualadh gu mionaideach, agus an uairsin a dhol air adhart chun cheum às-tharraing.Is dòcha nach bi homogenizers clò àbhaisteach èifeachdach ann a bhith ag aonachadh stuthan planntrais, agus sa chumantas chan eilear gam moladh.
5. Ro-chùram airson às-tharraing RNA
(1) Bu chòir sampallan clò-bhualaidh a bhith cho ùr ‘s as urrainn gus reothadh is leaghadh a sheachnadh.
(2) Bu chòir an clò a bhith làn talmhainn aig àm às-tharraing, agus cha bu chòir an ìre de stuth a bhith ro bheag, gun luaidh air cus.
(3) Bu chòir ùine brosnachaidh gu leòr a thoirt seachad às deidh an lysate a chuir ris gus an sampall a lìonadh gu h-iomlan.
(4) Nuair a bhios tu a’ cleachdadh modh Trizol airson às-tharraing, is e am prionnsapal a bhith a’ gabhail a-steach an supernatant às deidh srathachadh “nas lugha na inhale a bharrachd” a thoirt a-steach, agus chan fhaod e a thoirt a-mach don t-sreath mheadhanach, air neo bidh e ag adhbhrachadh fìor thruailleadh DNA genomic.
(5) Nuair a bhios tu a’ nighe, bu chòir don leaghan nighe a dhol a-steach gu tur timcheall balla an tiùba gus dèanamh cinnteach gun tèid a nighe gu mionaideach.
(6) Airson an dòigh tarraing a-mach colbh, a bharrachd air a bhith a’ dealachadh a’ cholbh às deidh a nighe, bu chòir an colbh assorption a chuir ann am being ultra-ghlan agus a shèideadh airson 5-10 mionaidean gus an t-solus organach a ghlanadh gu tiormachd.
(7) Aig an elution mu dheireadh den dòigh colbh, às deidh uisge DEPC a chuir ris, bu chòir a bhith air a bhrosnachadh airson 3-5 mionaidean, no bu chòir uisge DEPC a theasachadh gu 60 ° C ro-làimh gus an toradh elution àrdachadh.Anns an dòigh traidiseanta Trizol cleavage agus isopropanol sileadh, tha an RNA deireannach air a sgaoileadh ann an uisge DEPC, agus mar sin bu chòir ùine iomchaidh a thoirt seachad airson sgaoileadh, agus bu chòir bonn an tiùba centrifuge a bhith air a shèideadh gu leantainneach le tip pìoba.
3 Three Adhbharan agus fuasglaidhean airson dùmhlachd RNA ìosal / droch chàileachd
1. Tha an toradh ro ìosal
Tha an sampall a chaidh a thoirt a-mach ro ìosal, chan eil an àireamh iomlan gu leòr, no tha an sampall a chaidh a thoirt a-mach cus agus chan eil an lysis coileanta;bu chòir an clò no ceallan de chàileachd iomchaidh a chleachdadh airson às-tharraing, feumar ro-làimhseachadh an t-sampall a dhèanamh gu math, agus bu chòir an lysis a bhith gu leòr.
2. Genome fuigheall
Nuair a thèid an toirt a-mach le modh Trizol, nuair a thèid an supernatant a suathadh a-steach don t-sreath mheadhanach às deidh a bhith a ’laighe, bidh fìor thruailleadh genome air adhbhrachadh;bu chòir a bhith air leth faiceallach nuair a bhios tu a’ laighe gus nach tèid thu a-steach don t-sreath mheadhanach.Ma thèid an dòigh colbh a chleachdadh airson às-tharraing, faodar pasgan anns a bheil DNase I a thaghadh airson às-tharraing.Tha an searbhag niuclasach a tha air a shanasachadh air an membran air a chnàmh gu dìreach le DNase I, a dh’ fhaodadh fuigheall DNA a lughdachadh gu mòr.
3. RNA ìsleachadh
Dh’ fhaodadh gur e truailleadh an t-sampall a chaidh a thoirt a-mach e fhèin, no an truailleadh a dh’ adhbhraich rè a’ phròiseas às-tharraing;cho fada ‘s as urrainn, bu chòir sampallan ùra a chleachdadh airson às-tharraing RNA, agus bu chòir na sampallan cruinnichte a bhith air an stòradh ann an nitrigin leaghaidh no fuaradair -80 ° C ann an ùine, agus bu chòir reothadh is leaghadh a-rithist a sheachnadh.Bu chòir molaidhean an-asgaidh RNase/DNase, tiùban centrifuge agus stuthan eile a chleachdadh anns a’ phròiseas às-tharraing RNA.Bu chòir don phròiseas às-tharraing a bhith cho luath ‘s a ghabhas.Bu chòir an RNA a chaidh a thoirt a-mach a chuir air bogsa deigh agus a stòradh aig -80 ann an ùine.Ma dh’ fheumar an RNA a chaidh a thoirt a-mach a lorg le electrophoresis gel, bu chòir electrophoresis a dhèanamh dìreach às deidh a thoirt a-mach, agus bu chòir fear ùr ullachadh a chuir na àite am bufair electrophoresis.
4. Salann agus fuigheall fuasglaidh organach
Tha salainn phenol agus guanidine anns na h-ath-bheachdan às-tharraing, agus tha ethanol anns an fhuasgladh nighe.Rè a 'phròiseas às-tharraing, cha deach an lysate a ghabhail a-steach gu tur agus a thoirt air falbh, agus cha deach am fuasgladh nighe a thiormachadh gu tur.Tha salainn iarmharach agus solventan organach cronail air tar-sgrìobhadh cùil agus PCR às deidh sin.Diofar ìrean de chasg, agus mar sin bu chòir an lysate maothraidh a bhith air a thoirt air falbh gu tur tron phròiseas às-tharraing, agus bu chòir an nighe a bhith gu leòr gus an tèid na ballachan timcheall air an tiùb a nighe.A bharrachd air an sin, tha an tiùb air fhalamhachadh agus air a shèideadh na cheum riatanach, a lughdaicheas na tha air fhàgail de stuth organach tuilleadh.
Airson tuilleadh fiosrachaidh mu às-tharraing RNA, lean an làrach-lìn againn:
www.foreivd.com airson tuilleadh fiosrachaidh.
Ùine puist: Dùbhlachd-01-2022
