Ann an deuchainnean qPCR, tha dealbhadh primer cuideachd na cheangal glè chudromach.Tha co-dhiù a tha na primers freagarrach no nach eil ceangailte gu dlùth ri co-dhiù a tha an èifeachdas leudachaidh a’ ruighinn na h-ìre, a bheil na toraidhean leudaichte sònraichte, agus a bheil na toraidhean deuchainneach rim faighinn.
Mar sin ciamar a nì thu sònrachas primer qPCR nas fheàrr?Àrd-èifeachdas leudachaidh?
An-diugh, bheir sinn thu gu dealbhadh qPCR primers còmhla, agus leig le dealbhadh primer qPCR a bhith na sgil èifeachdach ann an deuchainnean.
Nuair a bhios tu a’ dealbhadh primers qPCR, mar as trice thoir aire do na puingean a leanas: bu chòir primers a dhealbhadh thairis air introns cho mòr ‘s as urrainn, bu chòir fad an toraidh a bhith 100-300 bp, bu chòir an luach Tm a bhith cho faisg’ s as urrainn air 60 ° C, agus bu chòir na primers suas is sìos an abhainn a bhith cho faisg ‘s a ghabhas, agus bu chòir deireadh a’ phrìomhaire a bhith G no C, msaa.
1. Dealbhadh primers thairis air introns
Nuair a bhios tu a’ dealbhadh primers qPCR, faodaidh taghadh primers air an dealbhadh thairis air introns casg a chuir air an teamplaid gDNA bho bhith ag àrdachadh, agus tha na toraidhean uile a ’tighinn bho leudachadh cDNA, mar sin a’ cur às do bhuaidh truailleadh gDNA.
2. Fad primer
Tha fad an primer sa chumantas eadar 18-30 nt, agus bu chòir fad an toraidh leudachaidh a bhith air a smachdachadh eadar 100-300 bp cho mòr ‘s as urrainn.
Ma tha am primer ro ghoirid, leanaidh e gu leudachadh neo-shònraichte, agus ma tha e ro fhada, bidh e furasta a chruthachadh structar àrd-sgoile (leithid structar hairpin).Ma tha an toradh leudachaidh ro fhada, chan eil e freagarrach airson freagairt polymerase, a bheir buaidh air èifeachdas àrdachadh PCR.
3. Susbaint GC agus luach Tm
Bu chòir smachd a chumail air susbaint GC de primers eadar 40% agus 60%.Ma tha e ro àrd no ro ìosal, chan eil e cuideachail am freagairt a thòiseachadh.Bu chòir susbaint GC de na primers air adhart agus air ais a bhith faisg air an aon rud gus an aon luach Tm agus teòthachd analachaidh fhaighinn.
Bu chòir an luach Tm a bhith eadar 55-65 ° C cho fada ‘s as urrainn, mar as trice timcheall air 60 ° C, agus bu chòir luach Tm an abhainn suas is sìos an abhainn a bhith cho faisg‘ s a ghabhas, agus as fheàrr gun a bhith nas àirde na 4 ° C.
4. Seachain a bhith a’ taghadh A aig deireadh 3 ′ den primer
Nuair a tha deireadh 3 ′ den primer mì-chothromach, tha eadar-dhealachaidhean mòra ann an èifeachdas synthesis diofar bhunaitean.Nuair a tha am bonn mu dheireadh A, faodaidh e cuideachd synthesis slabhraidh a thòiseachadh eadhon ged a tha mì-chothromachadh ann, agus nuair a tha am bonn mu dheireadh T Nuair a bhios, tha èifeachdas inntrigidh mì-chothromach air a lughdachadh gu mòr.Mar sin, feuch gun tagh thu A aig deireadh 3 ′ den primer, agus tha e nas fheàrr T.
Mas e primer probe a th’ ann, chan urrainn dha deireadh 5 ′ an probe a bhith G, oir eadhon nuair a tha aon bhunait G ceangailte ris a’ bhuidheann aithris fluorescent FAM, faodaidh G cuideachd an comharra flùraiseach a chuir am buidheann FAM a-mach a chuir às, a’ leantainn gu toraidhean àicheil meallta.Nochdadh.
5. Sgaoileadh bonn
Tha e nas fheàrr cuairteachadh nan ceithir bunaitean anns a’ primer air thuaiream, a’ seachnadh barrachd air 3 G no C leantainneach aig a’ cheann 3 ′, agus barrachd air 3 ann an sreath.Tha G no C furasta a ghineadh ann an roinn sreath beairteach GC.
6. Bu chòir don roinn dealbhaidh primer structaran àrd-sgoile iom-fhillte a sheachnadh.
Bheir an structar àrd-sgoile a chaidh a chruthachadh leis an aon shreath den toradh leudachaidh buaidh air adhartas rèidh PCR.Le bhith a’ ro-innse a bheil structar àrd-sgoile san t-sreath targaid ro-làimh, feuch ris an roinn seo a sheachnadh ann an dealbhadh primers.
7. Bu chòir dha na primers fhèin agus eadar na primers feuchainn ri bunaitean co-phàirteach leantainneach a sheachnadh.
Chan fhaod co-ionannachd 4 bunait leantainneach a bhith eadar am primer fhèin agus am primer.Cha bu chòir sreath co-phàirteach a bhith aig an primer fhèin, air neo bidh e ga phasgadh fhèin gus structar falt a chruthachadh, a bheir buaidh air a’ chothlamadh annealing den primer agus an teamplaid.
Chan urrainn sreathan co-phàirteach a bhith ann eadar primers suas an abhainn agus sìos an abhainn.Bheir co-fhreagarrachd eadar primers dimers primer, a lughdaicheas èifeachdas PCR agus eadhon a bheir buaidh air cruinneas cainneachdail.Mura h-urrainnear na structaran primer-dimer agus hairpin a sheachnadh, cha bu chòir an luach △G a bhith ro àrd (bu chòir a bhith nas lugha na 4.5 kcal / mol).
8. Bidh na primers ag àrdachadh an toradh targaid sònraichte.
Is e an amas mu dheireadh airson lorg qPCR a bhith a’ tuigsinn pailteas a’ ghine targaid.Ma thachras leudachadh neo-shònraichte, bidh an tomhas mearachdach.Mar sin, às deidh na primers a dhealbhadh, feumaidh iad a bhith air an deuchainn le BLAST, agus thathas a ’dèanamh coimeas eadar sònrachas nan toraidhean anns an stòr-dàta sreath.
An uairsin, bidh sinn a’ gabhail an gine daonna GAS6 (Growth 6 sònraichte) mar eisimpleir airson dealbhadh qPCR primers.
01 gine ceist
Homo GAS6tro NCBI.An seo, bu chòir dhuinn aire a thoirt do bhith a 'dèanamh coimeas eadar an t-ainm gine agus an gnè gus dèanamh cinnteach gu bheil iad cunbhalach.
02 Lorg an t-sreath gine
(1) Mas e DNA genomic an t-sreath targaid, tagh a’ chiad fhear, is e sin sreath DNA genomic a’ ghine.
(2) Mas e mRNA an t-sreath targaid, tagh an dàrna fear.Às deidh dhut a dhol a-steach, cliog air “CDS” sa chlàr gu h-ìosal.Is e an t-sreath cùl-dhonn an t-sreath còdaidh aig a’ ghine.
03 Dealbhadh primers
Cuir a-steach an eadar-aghaidh Primer-BLAST
Cuir a-steach an àireamh sreath gine no an t-sreath ann an cruth Fasta air an taobh chlì gu h-àrd, agus lìon a-steach na crìochan iomchaidh.

Cliog air “Faigh primers” agus nochdaidh NCBI dhut gus innse dhut gum bi taghadh paramadair mar sin air a leudachadh gu tionndaidhean splicing eile.Faodaidh sinn sgrùdadh a dhèanamh air na caochlaidhean splicing eadar-dhealaichte agus an cur a-steach gus am paidhir primer iomchaidh fhaighinn (mar a chithear san fhigear gu h-ìosal).Is dòcha gun toir am pròiseas seo deichean diogan airson a ruith.
Tha an teòthachd annealing de na paidhrichean primer sin uile timcheall air 60 ° C.A rèir adhbhar an deuchainn, tagh primers le fad meadhanach, deagh shònrachas agus nas lugha de fhèin-choileanadh de na primers airson an deuchainn, agus tha an ìre soirbheachaidh gu math àrd!
04 Dearbhadh sònrachaidh primer
Gu dearbh, a bharrachd air a bhith a’ dealbhadh primers, faodaidh Primer-Blast cuideachd measadh a dhèanamh air na primers a dhealbhaich sinn fhìn.Till chun duilleag dealbhaidh primer, cuir a-steach na primers suas an abhainn agus sìos an abhainn a dhealbhaich sinn, agus cha tèid paramadairean eile atharrachadh.Às deidh dhut a chuir a-steach, chì thu a bheil am paidhir primers ann cuideachd air ginean eile.Ma tha iad uile air an taisbeanadh air a’ ghine tha sinn airson leudachadh , a’ nochdadh gu bheil sònraichteachd a’ phaidhir primers seo sgoinneil!(Mar eisimpleir, is e seo an aon thoradh air a’ cheist primer!)

05 Breithneachadh càileachd primer
Dè an seòrsa primer a th’ ann am primer “foirfe” a tha a’ cothlamadh “èifeachdas leudachaidh suas gu ìre àbhaisteach”, “feartan toraidh leudaichte”, agus “toraidhean deuchainneach earbsach”?
Èifeachdas leudachaidh

lùb leaghaidh
Tha èifeachdas leudachaidh nan primers a’ ruighinn 90% -110%, a tha a’ ciallachadh gu bheil an èifeachdas leudachaidh math, agus tha aon stùc aig an lùb leaghaidh agus mar as trice Tm> 80 ° C, a tha a’ ciallachadh gu bheil an sònrachas leudachaidh math.
 
Bathar co-cheangailte:
Fìor-ùine PCR Easy – SYBR GREEN I
Fìor-ùine PCR Easy-Taqman