Tha PCR cainneachdail fluorescence (ris an canar cuideachd TaqMan PCR, ris an canar an-seo mar FQ-PCR) na theicneòlas cainneachdail searbhag niuclasach ùr a chaidh a leasachadh le PE (Perkin Elmer) anns na Stàitean Aonaichte ann an 1995. Tha an teicneòlas seo stèidhichte air PCR àbhaisteach le bhith a’ cur probes le bileagan flùraiseach ris.An coimeas ri PCR sùbailte, tha mòran bhuannachdan aig FQ-PCR gus a ghnìomhachd cainneachdail a thoirt gu buil.Tha an artaigil seo an dùil cunntas goirid a thoirt air feartan, prionnsapalan, dòighean agus cleachdadh an teicneòlais.
1 Feartan
Chan e a-mhàin gu bheil cugallachd àrd PCR àbhaisteach aig FQ-PCR, ach cuideachd air sgàth cleachdadh probes fluorescent, is urrainn dha atharrachadh comharra fluorescent a lorg gu dìreach rè leudachadh PCR tron t-siostam giùlain photoelectric gus toraidhean cainneachdail fhaighinn, a tha a’ faighinn thairis air mòran easbhaidhean ann an PCR gnàthach, agus mar sin tha e cuideachd aig ìre àrd sònraichte de hybridization DNA agus àrd chruinneas teicneòlas spectroscopy.
Mar eisimpleir, feumar sùil a chumail air toraidhean PCR coitcheann le electrophoresis gel agarose agus staining bromide ethidium le solas ultraviolet no le electrophoresis gel polyacrylamide agus staining airgid.Feumaidh seo chan e a-mhàin grunn ionnstramaidean, ach bheir e ùine agus oidhirp cuideachd.Tha na stains a thathar a’ cleachdadh Ethidium bromide cronail do chorp an duine, agus tha na modhan deuchainneach toinnte sin a’ toirt chothroman airson truailleadh agus nithean ceàrr.Ach, chan fheum FQ-PCR ach am mullach fhosgladh aon uair aig àm luchdachadh sampall, agus tha am pròiseas às deidh sin ag obair gu tur dùinte, nach eil feumach air post-giullachd PCR, a’ seachnadh mòran eas-bhuannachdan ann an gnìomhachd àbhaisteach PCR.Mar as trice bidh an deuchainn a’ cleachdadh an cearcall teirmeach ABI7100 PCR a chaidh a leasachadh le companaidh PE.
Tha na feartan a leanas aig an ionnstramaid: ① Iarrtas farsaing: Faodar a chleachdadh airson tomhas toraidh DNA agus RNA PCR, rannsachadh faireachdainn gine, lorg pathogen, agus optimachadh suidheachadh PCR.② Prionnsapal cainneachdail gun samhail: A’ cleachdadh probes le bileagan flùraiseach, cruinnichidh an ìre de fhlùorescence leis a’ chearcall PCR às deidh excitation laser, gus adhbhar cainneachdail a choileanadh.③ Èifeachdas obrach àrd: Rothaiche teirmeach 9600 PCR air a thogail a-steach, 1 gu 2 uair fo smachd coimpiutair gus leudachadh agus tomhas 96 sampall a chrìochnachadh gu fèin-ghluasadach agus gu sioncronach.④ Chan eil feum air electrophoresis gel: Chan eil feum air an sampall a lagachadh agus electrophoresis, dìreach cleachd probe sònraichte gus a lorg gu dìreach anns an tiùb freagairt.⑤ Gun truailleadh san loidhne-phìoban: Thathas a’ gabhail ris a’ phìob ath-bhualaidh làn-dùinte agus an siostam giùlain photoelectric, agus mar sin chan fheumar a bhith draghail mu thruailleadh.⑥ Tha na toraidhean ath-riochdachadh: tha an raon fiùghantach cainneachdail suas ri còig òrdughan meudachd.Mar sin, bhon a chaidh an teicneòlas seo a leasachadh gu soirbheachail, tha mòran de luchd-rannsachaidh saidheansail air a bhith a 'cur luach air agus chaidh a chleachdadh ann an iomadh raon.
2 Prionnsabalan agus dòighean-obrach
Is e prionnsapal obrach FQ-PCR gnìomhachd exonuclease 5 ′ → 3 ′ de Taq enzyme a chleachdadh gus probe le bileagan flùraiseach a chuir ris an t-siostam ath-bhualadh PCR.Faodaidh an probe a dhol còmhla gu sònraichte leis an teamplaid DNA a tha san t-sreath primer.Tha deireadh 5 ′ an probe air a chomharrachadh leis a’ ghine sgaoilidh fluorescence FAM (6-carboxyfluorescein, stùc sgaoilidh fluorescence aig 518nm), agus tha an deireadh 3 ′ air a chomharrachadh leis a’ bhuidheann quenching fluorescence TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence ′ 3mh stùc sgaoilidhean fluorescence aig 518nm), agus tha an 3 ′deireadh air a chomharrachadh leis a’ bhuidheann quenching fluorescence TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence ′8 an ìre as àirde de sgaoileadh phoileis-gineamhainn ′8. phorylated gus casg a chuir air an probe a bhith air a leudachadh aig àm leudachadh PCR.Nuair a dh’fhanas an probe slàn, bidh a’ bhuidheann quencher a’ cuir stad air sgaoilidhean fluorescence a’ bhuidheann sgaoilidhean.Aon uair ‘s gu bheil a’ bhuidheann sgaoilidhean air a sgaradh bhon bhuidheann quenching, thèid an casg a thogail, agus tha an dùmhlachd optigeach aig 518nm ag àrdachadh agus air a lorg leis an t-siostam lorg fluorescence. Anns an ìre ath-nuadhachaidh, bidh an probe a ’dol thairis air an teamplaid DNA, agus bidh an enzyme Taq anns an ìre leudachaidh a’ gluasad air feadh an teamplaid DNA le leudachadh air a ’phrìomhaire.Nuair a thèid an probe a ghearradh dheth, thèid a’ bhuaidh quenching a leigeil ma sgaoil agus thèid an comharra flùraiseach a leigeil ma sgaoil.A h-uile uair a thèid an teamplaid a chopaigeadh, thèid probe a ghearradh dheth, agus thèid comharra flùraiseach a leigeil ma sgaoil.Leis gu bheil dàimh aon-ri-aon eadar an àireamh de fluorophores a chaidh a leigeil ma sgaoil agus an àireamh de thoraidhean PCR, faodar an dòigh seo a chleachdadh gus an teamplaid a thomhas gu ceart.Mar as trice bidh an ionnstramaid deuchainneach a’ cleachdadh an cearcall teirmeach ABI7100 PCR a chaidh a leasachadh le companaidh PE, agus faodar baidhsagalan teirmeach eile a chleachdadh cuideachd.Ma thèid siostam ath-bhualadh seòrsa freagairt ABI7700 a chleachdadh airson an deuchainn, às deidh an ath-bhualadh a chrìochnachadh, faodar na toraidhean cainneachdail a thoirt seachad gu dìreach tro mhion-sgrùdadh coimpiutair.Ma chleachdas tu cearcallan teirmeach eile, feumaidh tu lorgaire fluorescence a chleachdadh gus an comharra fluorescence a thomhas anns an tiùb freagairt aig an aon àm gus RQ +, RQ-, △RQ obrachadh a-mach.Tha RQ + a’ riochdachadh a’ cho-mheas de dhian luminescence buidheann sgaoilidhean flùraiseach an t-sampall tube gu dian luminescence a’ bhuidheann quenching, tha RQ- a’ riochdachadh co-mheas na dhà anns an tiùb bàn, △RQ (△RQ=RQ=RQ+-RQ-) a’ riochdachadh na tha de dh’ atharrachadh chomharran flùraiseach rè PCR.Mar thoradh air toirt a-steach probes fluorescent, tha sònraichteachd an deuchainn air a leasachadh gu mòr.Mar as trice bu chòir dealbhadh an probe coinneachadh ris na cumhaichean a leanas: ① Bu chòir fad an probe a bhith timcheall air 20-40 bonn gus dèanamh cinnteach gu bheil an ceangal sònraichte.② Tha susbaint bhunaitean GC eadar 40% agus 60% gus dùblachadh de shreathan nucleotide singilte a sheachnadh.③ Seachain tar-fhilleadh no tar-lùbadh le primers.④ Tha seasmhachd a’ cheangail eadar an probe agus an teamplaid nas motha na seasmhachd a’ cheangail eadar an primer agus an teamplaid, agus mar sin bu chòir luach Tm an probe a bhith co-dhiù 5 ° C nas àirde na luach Tm a’ phrìomhaire.A bharrachd air an sin, tha dùmhlachd an probe, an homology eadar an probe agus an t-sreath teamplaid, agus an astar eadar an probe agus an primer uile a’ toirt buaidh air na toraidhean deuchainneach.
Bathar co-cheangailte:
Sìona Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Dèanadair agus Solaraiche |Foregene (foreivd.com)
Ùine puist: Dàmhair 15-2021
